قياس تنسخي سبان الحياة في الخميرة الناشيء.
Summary
في هذا المقال نقدم بروتوكول عام لقياس مدى الحياة تنسخي من الخلايا الأم الخميرة.
Abstract
الشيخوخة هي عملية التنكسية يتميز التدهور التدريجي لمكونات العضيات الخلوية ويؤدي إلى الوفاة. الخميرة في مهدها<em> السكيراء الجعوية</em> قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة بيولوجيا الشيخوخة ، وثبت العديد من المحددات طول العمر لتكون الخميرة المحفوظة في حقيقيات النوى متعددة الخلايا ، بما فيها الديدان والذباب والفئران<sup> 1</sup>. وقد يعاير بسبب عدم وجود الظواهر المرتبطة بالسن كميا بسهولة ، والشيخوخة في الخميرة على وجه الحصر تقريبا من خلال قياس العمر الافتراضي للخلايا في سياقات مختلفة ، مع اثنين من نماذج مختلفة تمتد الحياة في الاستعمال الشائع<sup> 2</sup>. عمر زمني يشير إلى طول الفترة الزمنية التي خلية الأم يمكن أن يعيش في حالة عدم تقسيم هدوء يشبه ، ويقترح أن تكون بمثابة نموذج للشيخوخة بعد الإنقسامية الخلايا في حقيقيات النوى متعددة الخلايا. تنسخي مدى الحياة ، في المقابل ، يشير عدد من الخلايا الوليدة التي تنتجها الخلايا الأم قبل الشيخوخة ، ويعتقد أن تقدم نموذجا للتقدم في السن في الخلايا النشطة mitotically. هنا نقدم بروتوكول معمم لقياس مدى الحياة تنسخي من الناشئين خلايا الخميرة الأم. هدف تمتد مقايسة تنسخي الحياة لتحديد عدد مرات كل براعم الخلية الأم. يمكن أن تكون الخلايا الأم وابنتها متباينة بسهولة من قبل ذوي الخبرة الباحث باستخدام مجهر الضوء القياسية (التكبير مجموع 160X) ، مثل Axioscope زايس 40 أو نموذج آخر للمقارنة. ويتحقق الفصل المادي بين الخلايا من خلايا والدة ابنته باستخدام micromanipulator دليل مجهزة إبرة الألياف البصرية. مختبر نموذجي سلالات إنتاج خلايا الخميرة ابنة 20-30 في تجربة واحدة من الأم وعمر يتطلب 2-3 أسابيع.
Protocol
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال منحة لعضو الكنيست وبانكوك من مؤسسة طبية إليسون. عضو الكنيست هو باحث طبي جديد اليسون مؤسسة في الشيخوخة. نود أن نشكر Soumya Kotireddy للحصول على المساعدة أثناء التصوير.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agar | Reagent | Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems) | DF0145-17-0 (214530) | |
| Bacto-Peptone | Reagent | Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems) | DF0118-17-0 (211677) | |
| Yeast Extract | Reagent | Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems) | DF0886-17-0 (288620) | |
| Glucose |
Riferimenti
- Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genet. 3, (2007).
- Kaeberlein, M., Conn, P. M. . Handbook of models for human aging. , 109-120 (2006).
- Smith, E. D. Quantitative evidence for conserved longevity pathways between divergent eukaryotic species. Genome Res. 18, 564-570 (2008).
- Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Replicative aging in yeast: the means to the end. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29-54 (2008).
- Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63, 113-121 (2008).
- Jiang, J. C., Jaruga, E., Repnevskaya, M. V., Jazwinski, S. M. An intervention resembling caloric restriction prolongs life span and retards aging in yeast. Faseb J. 14, 2135-2137 (2000).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Sir2-independent life span extension by calorie restriction in yeast. PLoS Biol. 2, E296-E296 (2004).
- Lin, S. J., Defossez, P. A., Guarente, L. Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae. Science. 289, 2126-2128 (2000).
- Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes. Mech Ageing Dev. 126, 17-21 (2005).
- Kaeberlein, M. Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients. Science. 310, 1193-1196 (2005).
