إيماس التصوير في خلايا الشبكية مع القطبين الميكروسكوب TIRF
Summary
في هذا الفيديو ، ونحن لشرح كيفية تسمية واحدة تصور إيماس حويصلة متشابك والاتجار في خلايا شبكية العين باستخدام القطبين ذهبية مجموع مضان الانعكاس الداخلي (TIRF) المجهري.
Abstract
مجموع الانعكاس الداخلي مضان (TIRF) المجهري هو الاسلوب الذي يسمح للدراسة الأحداث يحدث في غشاء الخلية ، من خلال التصوير الانتقائي للجزيئات الفلورسنت التي هي أقرب إلى مادة الانكسار ارتفاع الرقم القياسي مثل الزجاج<sup> 1</sup>. في هذه المقالة ، ونحن نطبق هذه التقنية لإيماس صورة حويصلات متشابك في خلايا الشبكية القطبين معزولة من الشبكية ذهبية. هذه الخلايا العصبية هي مناسبة جدا لهذا النوع من الدراسة بسبب هذه المحطات محور عصبي كبير. قبل التصحيح في وقت واحد لقط الخلايا القطبين ، فمن الممكن للتحقيق في العلاقة بين مرحلة ما قبل متشابك الجهد والإفراج متشابك<sup> 2،3</sup>. يتم تحميل حويصلات متشابك داخل الخلية محطات القطبين مع صبغة الفلورسنت (FM 1-43 ®) التي شاركت في النفخ الصبغة وإيجاد حل الجرس K يحتوي على ارتفاع<sup> +</sup> التركيز على المحطات متشابك. هذا depolarizes الخلايا ويحفز امتصاص الصبغة الإلتقام وما يترتب على ذلك إلى الحويصلات glutamatergic. بعد غسل الصبغة بعيدا عن نحو 30 دقيقة ، والخلايا التي تكون جاهزة للتصوير والتصحيح فرضت في وقت واحد مع ليزر 488 نانومتر. الحل ماصة التصحيح يحتوي على الببتيد المستندة رودامين التي تربط بشكل انتقائي للRIBEYE الشريط بروتين متشابك<sup> 4</sup> ، مما وسم الشرائط المصورة على وجه التحديد عند محطات مع ليزر 561 نانومتر. هذا يسمح للتوطين الدقيق للمناطق نشطة وفصل متشابك من خارج متشابك الأحداث.
Protocol
Discussion
مزايا المجهري TIRF الهدف من النوع هي أن 1) أنه يوفر sectioning البصرية ممتازة من خلال تقييد ضوء الإثارة إلى منطقة ضيقة داخل الطائرة البؤرية لهذا الهدف ، وبالتالي تقليل الخروج من تركيز الضوء ؛ 2) منذ قطرات الضوء بشكل كبير ، مع المسافة يمكن رصد حركة في اتجاه عمودي على أنه تغيير في كثافة مضا?…
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح EY 14990.
Riferimenti
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones. Nature. 406, 849-854 (2000).
- Zenisek, D. Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).
- Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. Visualizing synaptic ribbons in the living cell. J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Rouze, N. C., Schwartz, E. A. Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse. J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).
