Esocitosi imaging in cellule bipolari della retina con microscopia TIRF

Summary

In questo video ci dimostra come etichettare e visualizzare singole esocitosi delle vescicole sinaptiche e la tratta di pesci rossi cellule bipolari della retina mediante fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF) microscopia.

Abstract

Fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF) microscopia è una tecnica che permette lo studio di eventi che accadono a livello della membrana cellulare, con immagini selettivo di molecole fluorescenti che sono più vicini ad una sostanza alto indice di rifrazione come il vetro¹. In questo articolo, si applica questa tecnica per esocitosi immagine delle vescicole sinaptiche nelle cellule bipolari della retina isolata dalla retina pesci rossi. Questi neuroni sono molto adatti per questo tipo di studio a causa della loro terminali degli assoni di grandi dimensioni. Contemporaneamente cerotto di fissaggio le cellule bipolari, è possibile indagare il rapporto tra pre-sinaptica di tensione e rilascio sinaptico^2,3. Vescicole sinaptiche terminali all'interno delle cellule del bipolare sono caricati con un colorante fluorescente (FM 1-43 ®) per co-sbuffando il colorante e una soluzione contenente una suoneria alta K<sup> +</supConcentrazione> sui terminali sinaptici. Questo depolarizza le cellule e stimola endocitosi e conseguente assorbimento colorante in vescicole glutamatergica. Dopo aver lavato il colorante in eccesso per circa 30 minuti, le cellule sono pronte per essere cerotto bloccato e ripreso in contemporanea con un laser a 488 nm. La soluzione contiene una pipetta di patch rodamina basata peptide che si lega selettivamente alla proteina sinaptica Ribeye nastro⁴, In tal modo l'etichettatura nastri specificamente quando i terminali sono ripreso con un laser a 561 nm. Questo permette la localizzazione precisa delle zone attive e la separazione della sinaptica da eventi extra-sinaptico.

Protocol

Parte 1: Dissection e cella di isolamento bipolare Preparare le soluzioni di cui alla tabella 2; Il pH delle suonerie '(esterni) le soluzioni devono essere regolato a 7,4 con NaOH e il pH della soluzione interna deve essere regolato a 7,2 con CsOH. Proteggere la soluzione dalla luce interna con foglio di alluminio e conservarlo a 4 ° C fino all'utilizzo; Dark-adattare un pesce rosso per almeno 30 minuti prima della dissezione; Mentre l'animale scuro si adatta, preparare 5 ml d…

Discussion

I vantaggi di tipo oggettivo-microscopia TIRF sono che: 1) fornisce un'eccellente sezionamento ottico limitando luce di eccitazione ad una regione ristretta all'interno del piano focale dell'obiettivo, minimizzando così out-of-focus luce, 2) in quanto la luce diminuisce esponenzialmente con la distanza , il movimento in direzione verticale può essere monitorato come un cambiamento di intensità di fluorescenza, 3) la raccolta efficiente luce attraverso l'obiettivo ad alta apertura numerica ^1,5.

Il princi…