Retina Bipolar Hücreler TIRF Mikroskopi Görüntüleme ekzositoz
Summary
Bu video, etiket ve görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi kullanılarak goldfish retina bipolar hücreleri tek sinaptik vezikül ekzositoz ve ticareti nasıl göstermek.
Abstract
Toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu, cam gibi yüksek bir kırılma indisi maddeye yakın floresan moleküllerin seçici görüntüleme, hücre zarı meydana gelen olayların çalışma sağlayan bir tekniktir<sup> 1</sup>. Bu makalede, biz goldfish retina izole retinal bipolar hücreleri sinaptik veziküller görüntü ekzositoz için bu tekniği uygulamak. Bu nöronların, bu tür büyük akson terminallerinin nedeniyle çalışma için çok uygun. Bipolar hücreler sıkma aynı anda yama, presinaptik gerilim ve sinaptik salınımı arasındaki ilişkiyi araştırmak için mümkün<sup> 2,3</sup>. Bipolar hücre terminalleri içinde Sinaptik veziküller (FM 1-43 ®) floresan boya ile yüklenen şişirme yüksek K içeren boya ve bir zil çözümü<sup> +</sup> Sinaptik terminaller üzerine konsantrasyon. Bu hücreler depolarizes ve glutamaterjik veziküller içine endositoz ve buna bağlı olarak boya alımını uyarır. Yaklaşık 30 dakika uzaklıkta aşırı boya yıkadıktan sonra, hücreler, yama kelepçeli ve 488 nm lazer ile aynı anda görüntülü olmak için hazırız. Yama pipet çözüm, sinaptik şerit protein RIBEYE seçici bağlar rodamin tabanlı peptid içeren<sup> 4</sup> Terminalleri 561 nm lazer ile görüntülü ve böylece özellikle şeritler etiketleme. Bu aktif olan bölgelerin kesin lokalizasyonu ve ekstra sinaptik olayları sinaptik ayrılmasını sağlar.
Protocol
Discussion
Işık mesafe ile katlanarak düşer bu yana 2); objektif tip TIRF mikroskopi avantajları 1), böylece ışık-odak en aza indirmek amacı, odak düzlemi içinde dar bir bölgeye uyarma ışık kısıtlayarak mükemmel optik kesit sağladığı floresan yoğunluğunda bir değişiklik olarak, dikey yönde hareket izlenebilir; 3) yüksek sayısal açıklık hedefi 1,5 ile verimli bir ışık toplama .
Bu tekniğin en önemli dezavantajı, elektron mikroskobu ile ultra ince bölümüne eşdeğerdir hücre yüzeyi, 100 ve m…
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, Grant EY 14990 tarafından desteklenen oldu.
Riferimenti
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones. Nature. 406, 849-854 (2000).
- Zenisek, D. Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).
- Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. Visualizing synaptic ribbons in the living cell. J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Rouze, N. C., Schwartz, E. A. Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse. J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).
