L'exocytose imagerie dans les cellules bipolaires rétine par microscopie TIRF

Summary

Dans cette vidéo, nous démontrons comment étiqueter et de visualiser seule exocytose des vésicules synaptiques et la traite des cellules rétiniennes bipolaires poissons rouges en utilisant la fluorescence totale internes réflectance (FRBR) microscopie.

Abstract

Réflectance interne totale de fluorescence (FRBR) microscopie est une technique qui permet l'étude des événements qui se déroulent à la membrane cellulaire, l'imagerie par sélectif des molécules fluorescentes qui sont proches d'une substance indice de réfraction élevé, comme le verre¹. Dans cet article, nous appliquons cette technique à l'exocytose image de vésicules synaptiques dans les cellules rétiniennes bipolaires isolés de la rétine des poissons rouges. Ces neurones sont très convenable pour ce genre d'étude en raison de leur grande terminaisons axonales. Par simultanément patch clamp les cellules bipolaires, il est possible d'étudier la relation entre la tension pré-synaptique et la libération synaptique^2,3. Les vésicules synaptiques l'intérieur des terminaux cellulaires bipolaires sont chargées avec un colorant fluorescent (FM 1-43 ®) par la co-soufflant le colorant et une solution de Ringer contenant un K élevé<sup> +</supConcentration> sur le terminaisons synaptiques. Cette dépolarise les cellules et stimule l'endocytose et conséquente absorption de colorants dans les vésicules glutamatergique. Après le lavage l'excès de colorant loin pour environ 30 minutes, les cellules sont prêtes pour être serré de patch et imagé simultanément avec un laser à 488 nm. La solution la pipette de patch contient un peptide rhodamine base qui se lie sélectivement à l'RIBEYE protéines synaptiques ruban⁴, Ce qui l'étiquetage des rubans spécifiquement lorsque les terminaux sont imagés avec un laser 561 nm. Cela permet la localisation précise des zones actives et la séparation des synaptique à partir des événements extra-synaptiques.

Protocol

Partie 1: Dissection et isolement des cellules bipolaires Préparer des solutions énumérées dans le tableau 2; Le pH de sonneries '(extérieurs) des solutions devraient être ajusté à 7,4 avec NaOH et le pH de la solution interne devrait être ajusté à 7,2 avec CsOH. Protéger la solution interne de la lumière avec du papier aluminium et gardez à 4 ° C jusqu'à leur utilisation; Dark-adapter un poisson rouge pendant au moins 30 minutes avant la dissection; Alors que l&#39…

Discussion

Les avantages de l'objectif de type microscopie TIRF sont que 1) il fournit une excellente sectionnement optique en limitant la lumière d'excitation à une région étroite dans le plan focal de l'objectif, minimisant ainsi les focus-du-léger; 2) car la lumière tombe exponentiellement avec la distance , le mouvement dans une direction verticale peut être surveillé comme un changement dans l'intensité de fluorescence; 3) la collecte efficace de la lumière à travers l'objectif d'ouverture numérique élevée <s…