Изображений экзоцитоза в клетки сетчатки Биполярный с Микроскопия TIRF
Summary
В этом видео показано, как на этикетке и визуализировать один синаптических пузырьков экзоцитоза и торговлей золотыми рыбками биполярных клеток сетчатки использованием полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) микроскопии.
Abstract
Полное внутреннее отражение флуоресценции (TIRF) микроскопия является метод, который позволяет изучать события, происходящие на клеточную мембрану, селективного изображений флуоресцентных молекул, которые находятся ближе всего к высоким показателем преломления вещества, такие как стекло<sup> 1</sup>. В этой статье мы применяем эту технику, чтобы изображение экзоцитоза синаптических пузырьков в биполярных клеток сетчатки изолированы от золотой рыбки сетчатки. Эти нейроны очень подходит для такого рода исследования из-за их больших терминалов аксона. При одновременном патч зажима биполярные клетки, можно исследовать отношения между пресинаптических напряжения и синаптических релиз<sup> 2,3</sup>. Synaptic пузырьков внутри терминалов биполярные ячейки загружаются с флуоресцентным красителем (FM 1-43 ®) путем совместного пыхтя красителя и звонка раствор, содержащий высокие K<sup> +</sup> Концентрация на синаптических терминалов. Это деполяризует клеток и стимулирует эндоцитоз и последующее поглощение красителя в глутаматергической пузырьков. После мытья избыток красителя далеко в течение около 30 минут, клетки готовы за то, что патч зажат и отображение одновременно с 488 нм лазер. Решение патч пипетки содержит родамина основе пептида, который избирательно связывается с белком синаптических Рибай лента<sup> 4</sup>, Таким образом, маркировка ленты особенно когда терминалы, полученную с использованием 561 нм лазер. Это позволяет точную локализацию активных зон и разделение синаптических от экстра-синаптических событий.
Protocol
Discussion
Преимущества объективного типа микроскопии TIRF в том, что 1) он обеспечивает отличные оптические секционирования, ограничивая возбуждающего света к узкой области в фокальной плоскости объектива, тем самым минимизируя вне фокусировать свет, 2), поскольку световые капли экспоненциально с расстояни?…
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH Грант EY 14990.
Riferimenti
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones. Nature. 406, 849-854 (2000).
- Zenisek, D. Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).
- Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. Visualizing synaptic ribbons in the living cell. J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Rouze, N. C., Schwartz, E. A. Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse. J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).
