הדמיה Exocytosis בתאים עם הפרעה דו רשתית מיקרוסקופית TIRF
Summary
בסרטון זה אנו מדגימים כיצד התווית לדמיין שלפוחית יחיד exocytosis הסינפטי וסחר רשתית דג זהב תאים דו קוטבית באמצעות הקרינה הכוללת פנימי ההחזרה (TIRF) מיקרוסקופיה.
Abstract
החזר סך פנימית הקרינה (TIRF) מיקרוסקופיה היא טכניקה המאפשרת לימוד של אירועים קורה קרום התא, על ידי הדמיה סלקטיבית של מולקולות ניאון, כי הם הקרובים ביותר חומר המדד גבוה השבירה כגון זכוכית<sup> 1</sup>. במאמר זה, אנו מיישמים את הטכניקה הזו כדי exocytosis תמונה של שלפוחית סינפטית של תאים ברשתית דו קוטבית מבודד הרשתית דגי זהב. נוירונים אלה מתאימים מאוד לסוג זה של מחקר בגלל מסופי האקסון גדול שלהם. על ידי לחיצה בו זמנית תיקון התאים דו קוטבית, ניתן לחקור את הקשר בין מתח טרום סינפטית ושחרור הסינפטי<sup> 2,3</sup>. שלפוחית Synaptic בתוך התא מסופי דו קוטבית נטענים עם פלורסנט לצבוע (FM 1-43 ®) על ידי שיתוף ומתנשף לצבוע ופתרון הצלצול המכיל K גבוה<sup> +</sup> ריכוז על המסופים הסינפטיים. זה depolarizes התאים ומעורר ספיגת צבע וכתוצאה מכך אנדוציטוזה לתוך שלפוחית glutamatergic. לאחר שטיפת צבע עודף משם כ 30 דקות, תאים מוכנים להיות תיקון הידק הדמיה בו זמנית עם לייזר 488 ננומטר. הפתרון פיפטה תיקון מכילה פפטיד rhodamine מבוסס נקשר באופן סלקטיבי את RIBEYE סרט הסינפטי חלבון<sup> 4</sup>, ובכך תיוג סרטים במיוחד כאשר מסופי הם צילמו עם לייזר 561 ננומטר. זה מאפשר איתור מדויק של אזורי פעיל הפרדת הסינפטי מ חוץ הסינפטי האירועים.
Protocol
Discussion
היתרונות של מיקרוסקופיה TIRF אובייקטיבית מסוג הן כי 1) הוא מספק חתך אופטית מעולה ידי הגבלת אור עירור לאזור צר בתוך המטוס מוקד של המטרה, ובכך לצמצם out-of-להתמקד אור; 2) מאז אור טיפות אקספוננציאלית עם המרחק תנועה בכיוון אנכי ניתן לנטר כשינוי עוצמת הקרינה, 3) אוסף אור יעיל דרך אובייקטיבית …
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH גרנט EY 14990.
Riferimenti
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones. Nature. 406, 849-854 (2000).
- Zenisek, D. Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).
- Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. Visualizing synaptic ribbons in the living cell. J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Rouze, N. C., Schwartz, E. A. Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse. J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).
