在这个视频中,我们演示了如何标记和可视化单突触囊泡的胞吐贩卖和使用总内部反射荧光(TIRF)显微镜在金鱼视网膜双极细胞。
共有内部反射荧光(TIRF)显微镜是一种技术,使细胞膜发生的事件的研究是最接近高折射指数物质,如玻璃的荧光分子的选择性成像,<sup> 1</sup>。在这篇文章中,我们应用此技术从金鱼视网膜视网膜双极细胞的突触囊泡的胞吐形象。这些神经元是非常适合这种学习,由于其巨大的轴突终端。同时夹紧双极细胞的修补程序,它是可能的调查之间的突触前电压和突触释放的关系<sup> 2,3</sup>。突触小泡内的双极细胞端子装有一个荧光染料(调频1-43 ®)合作膨化染料和林格液含有高K<sup> +</sup>到突触终端的浓度。这种去极化的细胞,刺激成谷氨酸囊泡内吞作用和随之而来的上染率。洗涤多余的染料,大约30分钟后,细胞被夹住的补丁,并同时与488 nm激光成像准备。该补丁吸管解决方案包含一个基于罗丹明的肽结合选择性突触带状蛋白质肉眼<sup> 4</sup>,从而标签色带特别是当终端与561 nm激光成像。这使得活跃区的精确定位和分离的突触的突触事件。
客观型TIRF显微镜的优点是:1)激发光在焦平面的客观限制在一个狭小的区域提供优良的光学切片,从而最大限度地减少了集中光线; 2)由于光线与距离成指数下降荧光强度的变化,可以在垂直方向的运动进行监测; 3)通过高数值孔径的目标1,5的高效率的光收集。
该技术的主要缺点是,它是有限的成像事件发生在100纳米的细胞表面,这是大致相当于一个在电子显微镜超薄切片。因此,坚持以玻璃的?…
这项工作是由美国国立卫生研究院批准安永14990支持。