TIRF 현미경과 망막 바이폴라 세포 이미징 Exocytosis
Summary
이 비디오에서는, 우리는 총 내부 반사율의 형광 (TIRF) 현미경을 사용하여 금붕어 망막 바이폴라 세포에서 단일 시냅스 소포의 exocytosis와 인신 매매를 라벨 및 시각화하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
총 내부 반사율 형광 (TIRF) 현미경은 유리 같은 높은 굴절률 물질에 가까운 형광 분자의 선택적 이미징에 의해 세포막에서 일어나는 사건의 연구를 수있게 해주는 기술입니다<sup> 1</sup>. 이 문서에서는, 우리는 금붕어 망막으로부터 격리 망막 바이폴라 세포의 시냅스 vesicles의 이미지 exocytosis이 기술을 적용할 수 있습니다. 이 뉴런들은 대형 축삭 터미널로 인해 이런 종류의 연구에 매우 적합합니다. 양극성 세포를 클램핑 동시에 패치함으로써, 사전 시냅스 전압과 시냅스 릴리스 사이의 관계를 조사 수 있습니다<sup> 2,3</sup>. 양극성 세포 터미널 내부 시냅스 vesicles가에 의해 형광 염료 (FM 1-43 ®)와 함께 로드된 공동 피고 높은 K를 포함하는 염료와 닮은 솔루션<sup> +</sup시냅스 터미널에> 집중. 이것은 세포를 depolarizes하고 glutamatergic vesicles에 endocytosis와 결과의 염료 이해를 촉진. 약 30 분 거리에 여분의 염료를 세척 후, 전지는 패치가 고정되어와 488 nm의 레이저와 동시에 몇 군데 것에 대해 준비가되어 있습니다. 패치 피펫 솔루션은 시냅스 리본 단백질 RIBEYE을 선택 바인딩 rhodamine 기반의 펩티드를 포함<sup> 4</sup> 단말기가 561 nm의 레이저로 몇 군데있을 때이를 구체적으로 리본을 라벨. 이것은 활성 영역의 정확한 현지화 및 추가 – 시냅스 이벤트에서 시냅스의 분리 수 있습니다.
Protocol
Discussion
빛이 거리와 함께 기하 급수적으로 방울 년부터 2) 목적 형 TIRF 현미경의 장점은 1) 그함으로써 빛을 – 오브 – 초점 밖으로 최소화 목적의 초점 평면 내의 좁은 지역에 여기 광을 제한함으로써 우수한 광학 sectioning을 제공한다는 점입니다 , 수직 방향으로 움직임은 형광 강도의 변화로 모니터링할 수 있으며, 높은 수치 조리개 목적 1.5을 통해 3) 효율적인 조명 컬렉션.
기술의 주요 단점은 그것이 전자 …
Acknowledgements
이 작품은 NIH 그랜트 어이 14990에 의해 지원되었다.
Riferimenti
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones. Nature. 406, 849-854 (2000).
- Zenisek, D. Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).
- Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. Visualizing synaptic ribbons in the living cell. J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Rouze, N. C., Schwartz, E. A. Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse. J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).
