Imaging exocytos i näthinnan bipolär Celler med TIRF Mikroskopi

Summary

I denna video visar vi hur du kan märka och visualisera enda synaptiska vesikler exocytos och handel med guldfiskar retinal bipolära celler med total inre reflektans fluorescens (TIRF) mikroskopi.

Abstract

Total inre reflektans fluorescens (TIRF) mikroskopi är en teknik som gör det möjligt att studera händelser som händer i cellmembranet, genom selektiv avbildning av fluorescerande molekyler som ligger närmast ett högt brytningsindex ämne som glas¹. I denna artikel använder vi denna teknik för att bilden exocytos av synaptiska blåsor i näthinnans bipolära celler som isolerats från guldfisk näthinnan. Dessa nervceller är mycket lämpliga för denna typ av studie på grund av deras stora Axon terminaler. Genom att samtidigt patch fastspänning den bipolära celler är det möjligt att undersöka sambandet mellan presynaptisk spänning och synaptic släpp^2,3. Synaptic blåsor inuti bipolära cellen terminaler är laddade med en fluorescerande färg (FM 1-43 ®) vid samtidig pusta färgen och en ringsignal lösning som innehåller en hög K⁺ Koncentration på den synaptiska terminaler. Detta depolarizes cellerna och stimulerar endocytos och därav färgen upptag i glutamaterg blåsor. Efter tvättning av överflödig färg bort för cirka 30 minuter, celler är redo för att vara lapp fastklämd och avbildat samtidigt med en 488 nm laser. Plåstret pipett Lösningen innehåller en Rhodamine-baserade peptid som binder selektivt till det synaptiska bandet proteinet Ribeye⁴, Och därigenom märkning band speciellt när terminaler är avbildade med en 561 nm laser. Detta gör den exakta lokaliseringen av aktiva zoner och separation av synaptiska från extra-synaptiska händelser.

Protocol

Del 1: Dissection och bipolär Cell Isolation Förbered lösningarna enligt tabell 2, pH ringsignaler "(extern) bör lösningar justeras till 7,4 med NaOH och pH-värdet av den interna lösningen ska justeras till 7,2 med CsOH. Skydda intern lösning från ljus med aluminiumfolie och förvara den i 4 ° C fram till användning; Dark-anpassa en guldfisk i minst 30 minuter före dissektion; Medan djuret mörka anpassar sig, förbereda 5 ml hyaluronidas (typ V hyaluronidas, 1100 enheter …

Discussion

Fördelarna med objektiv-typ TIRF mikroskopi är att 1) ​​det ger utmärkta optiska sektionering genom att begränsa excitation ljuset till en smal region inom fokalplan målet, vilket minimerar out-of-fokus ljus, 2) eftersom ljuset faller exponentiellt med avståndet kan rörelse i lodrät riktning skall övervakas som en förändring av fluorescensintensiteten, 3) ett effektivt ljus insamling genom höga numeriska bländaröppningen mål ^1,5.

Den största nackdelen med tekniken är att den är begränsad till avbild…