Overview
Dit artikel beschrijft DNA-extractie uit zebravisstaartclip. Het protocol demonstreert een snelle en efficiënte methode om zebravis genotypen te analyseren.
Protocol
1. DNA-voorbereiding
- Bereid DNA-lysisbuffer voor: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Voeg verse Proteinase K toe aan een eindconcentratie van 1 mg/ml op de dag van gebruik.
- Weefselverzameling:
- Voor volwassen visvin clip:
- Verdoof de vis: Plaats de vis in 0,004% MS-222 (tricaine) oplossing. Wacht tot de kieuwbeweging vertraagt.
- Leg vis op een stapel van 5-10 Kimwipes en snijd een klein stukje van de staartvin, ongeveer 2-3 mm, met een steriel scheermesje.
- Plaats de vis snel in een gelabelde tank met zoet water voor herstel; etiketteer zorgvuldig zowel de tank als de bijbehorende buis die de vinclip bevat. Ververs het water en voer de vis om de andere dag.
- Pak de vinklem op met een steriele pipetpunt en breng deze over in een buis gevuld met 100 μl DNA-lysisbuffer.
- Gooi de pipettip weg en gooi het scheermesje weg in een scherpe container.
- Voor embryo staart clip:
- Plaats embryo's in 0,004% MS-222 (tricaïne) oplossing. Wacht 2 minuten.
- Snijd een stuk staart met een tang onder een ontledende microscoop.
- Doe de staart in een gelabelde buis gevuld met 30 μl DNA-lysisbuffer.
- Doe het embryo snel in een buis met 100 μl 4% paraformaldehyde.
- Etiketbuizen met embryo's en de bijbehorende staartbuizen.
- Bewaar de buisjes met embryo's 's nachts bij 4 °C voor fixatie.
- Reinig de tang met Milli-Q water en Kimwipes tussen elk embryo om besmetting te minimaliseren.
- Voor hele embryo's:
- Plaats embryo's in 0,004% MS-222 (tricaïne) oplossing. Wacht 2 minuten.
- Doe 1-5 embryo's in een buis gevuld met 100 μl DNA-lysisbuffer. Dechorionatie is niet nodig.
- Voor volwassen visvin clip:
- DNA-spijsvertering
Incubeer buizen met weefsel (vin- of staartclips of embryo's) bij 55 °C gedurende 4 uur tot 's nachts. - Inactiveer de Proteinase K
Warmtebuizen tot 95 °C gedurende 15 min. DNA moeten onmiddellijk voor PCR worden gebruikt of maximaal 3 maanden bij -20 °C worden bewaard.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
Tricaine | |||
Paraformaldehyde |