Estrazione del DNA dalla clip di coda: un metodo utilizzato nel genotipizzazione del pesce zebra

Overview

Questo articolo descrive l'estrazione del DNA dalla clip di coda zebrafish. Il protocollo dimostra un metodo rapido ed efficiente per analizzare i genotipi zebrafish.

Protocol

1. Preparazione del DNA

1. Preparare il tampone dilisi del DNA: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 0.3% Tween 20, 0.3% NP40. Aggiungere proteinasi K fresca ad una concentrazione finale di 1 mg/ml il giorno dell'uso.
2. Raccolta dei tessuti:
   1. Per clip di pinne di pesce adulto:
      1. Anestetizzare il pesce: Mettere il pesce in soluzione 0,004% MS-222 (tricaina). Aspetta che il movimento branchiali rallenti.
      2. Metti il pesce su una pila di 5-10 Kimwipes e taglia un piccolo pezzo di pinna caudale, circa 2-3 mm, con una lama sterile.
      3. Posizionare rapidamente il pesce in un serbatoio etichettato con acqua dolce per il recupero; etichettare con cura sia il serbatoio che il tubo corrispondente che conterrà la clip dell'aletta. Cambia l'acqua e dai da mangiare al pesce a giorni nostri.
      4. Raccogliere la clip della pinna con una punta sterile di pipetta e trasferirla in un tubo riempito con tampone di lysis del DNA da 100 μl.
      5. Scartare la punta della pipetta e scartare la lama del rasoio in un contenitore affilato.
   2. Per clip coda embrione:
      1. Mettere gli embrioni nella soluzione 0,004% MS-222 (tricaina). Aspetta 2 minuti.
      2. Tagliare un pezzo di coda con le forcep al microscopio di sezionazione.
      3. Mettere la coda in un tubo etichettato riempito con tampone di lisi del DNA da 30 μl.
      4. Mettere rapidamente l'embrione in un tubo contenente 100 μl 4% di paraformaldeide.
      5. Etichettare i tubi con embrioni e i corrispondenti tubi di coda.
      6. Conservare i tubi con embrioni a 4 °C durante la notte per la fissazione.
      7. Pulire le forcep utilizzando acqua Milli-Q e Kimwipes tra ogni embrione per ridurre al minimo la contaminazione.
   3. Per embrioni interi:
      1. Mettere gli embrioni nella soluzione 0,004% MS-222 (tricaina). Aspetta 2 minuti.
      2. Mettere 1-5 embrioni in un tubo riempito con tampone di lisi del DNA da 100 μl. La decorrionazione non è necessaria.
3. Digestione del DNA
   Incubare tubi con tessuto (clip di pinne o coda o embrioni) a 55 °C per 4 ore fino a durante la notte.
4. Inattivare la proteinasi K
   I tubi di calore a 95 °C per 15 minuti di DNA devono essere utilizzati immediatamente per pcr o conservati a -20 °C per un massimo di 3 mesi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Reaction LightScanner Master Mix	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Tricaine
Paraformaldehyde