テールクリップからのDNA抽出:ゼブラフィッシュジェノタイピングに用いられる方法

Overview

この記事ではゼブラフィッシュテールクリップからのDNA抽出について説明します。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ遺伝子型を分析するための迅速かつ効率的な方法を実証する。

Protocol

1. DNAの調製

1. DNAリシスバッファーを調製:50 mM KCl、10 mM Tris-HCl pH 8.3、0.3% Tween 20, 0.3% NP40.使用日に1mg / mlの最終濃度に新鮮なプロテイナーゼKを加えます。
2. 組織コレクション:
   1. 大人の魚のひれクリップの場合:
      1. 魚を麻酔:0.004% MS-222 (トリカイン) 溶液に魚を置きます.ギルの動きが遅くなるまで待ちます。
      2. 5-10キムワイプのスタックに魚を置き、滅菌カミソリの刃で、尾ひれの小片、約2〜3ミリメートルをカットします。
      3. すぐに回復のための淡水とラベル付けされたタンクに魚を配置します。フィンクリップを含むタンクと対応するチューブの両方に注意深くラベルを付けます。水を交換し、一日おきに魚を養います。
      4. 滅菌ピペットチップでフィンクリップをピックアップし、100 μl DNAリシスバッファーで満たされたチューブに移します。
      5. ピペットの先端を捨て、カミソリの刃を鋭い容器に捨てます。
   2. 胚テールクリップの場合:
      1. 胚を0.004%MS-222(トリカイン)溶液に入れる。2分待ちます。
      2. 解剖顕微鏡の下で鉗子で尾片を切る。
      3. 30 μl の DNA リシス バッファーを充填した標識チューブに尾を入れます。
      4. 100 μl 4% パラホルムアルデヒドを含むチューブに素早く胚を入れます。
      5. 胚とそれに対応する尾管を持つラベルチューブ。
      6. 固定のために一晩4°Cで胚とチューブを保管してください。
      7. ミリQ水と各胚間のキムワイプを使用して鉗子をきれいにして、汚染を最小限に抑えます。
   3. 全胚の場合:
      1. 胚を0.004%MS-222(トリカイン)溶液に入れる。2分待ちます。
      2. 100 μl の DNA リシス バッファーを充填したチューブに 1 ~5 個の胚を入れます。デコールリオネーションは必要ありません。
3. DNA消化
   55°Cで、一晩4時間、組織(フィンまたはテールクリップまたは胚)を用いてチューブをインキュベートする。
4. プロテアーゼKを不活性化する
   15分間の熱管を15分間の熱管で使用するDNAは、すぐにPCRに使用するか、-20°Cで最大3ヶ月間保存する必要があります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Reaction LightScanner Master Mix	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Tricaine
Paraformaldehyde