Extracción de ADN del clip de cola: un método utilizado en el genotipado de pez cebra

Overview

Este artículo describe la extracción de ADN del clip de cola de pez cebra. El protocolo demuestra un método rápido y eficiente para analizar los genotipos de pez cebra.

Protocol

1. Preparación del ADN

1. Preparar el búfer de lisis de ADN: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 0.3% Tween 20, 0.3% NP40. Añadir proteinasa K fresca a una concentración final de 1 mg/ml el día de uso.
2. Recolección de tejidos:
   1. Para clip de aleta de pescado para adultos:
      1. Anestesiizar peces: Coloque el pescado en solución 0.004% MS-222 (tricarina). Espere hasta que el movimiento de las branquias se ralentice.
      2. Ponga pescado en una pila de 5-10 Kimwipes y corte un pequeño trozo de la aleta de cola, de unos 2-3 mm, con una hoja de afeitar estéril.
      3. Coloque rápidamente el pescado en un tanque etiquetado con agua dulce para su recuperación; etiquete cuidadosamente tanto el tanque como el tubo correspondiente que contendrá el clip de aleta. Cambia el agua y alimenta a los peces cada dos días.
      4. Coja el clip de aleta con una punta de pipeta estéril y transfiéralo a un tubo lleno de 100 μl de tampón de lisis de ADN.
      5. Deseche la punta de la pipeta y deseche la cuchilla de afeitar en un recipiente afilado.
   2. Para clip de cola de embrión:
      1. Coloque los embriones en una solución 0,004% MS-222 (tricarina). Espera 2 min.
      2. Corta un trozo de cola con fórceps bajo un microscopio diseccionador.
      3. Coloque la cola en un tubo etiquetado lleno de 30 μl de tampón de lisis de ADN.
      4. Poner rápidamente el embrión en un tubo que contiene 100 μl 4% paraformaldehído.
      5. Etiqueta tubos con embriones y sus correspondientes tubos de cola.
      6. Almacene los tubos con embriones a 4 °C durante la noche para su fijación.
      7. Limpie los fórceps usando agua Milli-Q y Kimwipes entre cada embrión para minimizar la contaminación.
   3. Para embriones enteros:
      1. Coloque los embriones en una solución 0,004% MS-222 (tricarina). Espera 2 min.
      2. Poner 1-5 embriones en un tubo lleno de 100 μl de tampón de lisis de ADN. La desconominación no es necesaria.
3. Digestión del ADN
   Incubar tubos con tejido (clips de aleta o cola o embriones) a 55 °C durante 4 horas hasta la noche.
4. Inactivar la Proteinase K
   Los tubos de calor a 95 °C durante 15 min. EL ADN debe utilizarse para PCR inmediatamente, o almacenarse a -20 °C durante un tiempo de hasta 3 meses.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Reaction LightScanner Master Mix	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Tricaine
Paraformaldehyde