تقارب المرحلة السائلة الفحص التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي لدراسة البروتين البروتين التفاعل: المثال فيروس شلل الأطفال، Nanobody
Summary
في هذه المقالة، وقدم، كمية بسيطة، وتقارب مرحلة فحص السائل الالتقاط. هذا هو أسلوب موثوق بها على أساس التفاعل بين حبات مغناطيسية والبروتينات الموسومة (على سبيل المثال nanobodies) من ناحية، والتقارب بين بروتين المفتاحية والثانية، والبروتين المسمى (مثل فيروس شلل الأطفال) من جهة أخرى.
Abstract
في هذه المقالة، وقدم، كمية بسيطة، وتقارب مرحلة فحص السائل الالتقاط. بشرط أن يكون المفتاحية واحد من البروتين والمسمى بروتين آخر، لا يمكن تنفيذ هذا الأسلوب من أجل التحقيق في البروتين البروتين التفاعلات. لأنه يقوم على يد واحدة على الاعتراف من البروتين الموسومة بواسطة حبات الكوبالت المغناطيسي المغلفة و من ناحية أخرى على التفاعل بين المعلمة وبروتين بروتين معين 2 الذي يسمى. أولا، يتم خلط البروتينات المسماة والموسومة وحضنت في درجة حرارة الغرفة. تضاف حبات المغناطيسي، والتي تعترف علامة، ويتم فصل جزء محدد من البروتين المسمى من الكسر غير منضم باستخدام مغناطيس. ويمكن تحديد كمية البروتين المسمى التي يتم التقاطها بطريقة غير مباشرة عن طريق قياس إشارة من البروتين المسمى بقي في جزء غير منضم. الطور السائل ووصف تجربة التقارب مفيد للغاية عندما البروتينات تحويل متعلق بتكوين جزئي الحساسة والحمارعايد. ويتجلى في وضع وتطبيق فحص للتفاعل بين فيروس شلل الأطفال وفيروس شلل الأطفال الاعتراف nanobodies 1. فيروس شلل الأطفال منذ حساسة للتحويل متعلق بتكوين جزئي 2 عندما تعلق على سطح صلب (نتائج غير منشورة)، ويقتصر استخدام ELISA، وينبغي لذلك يفضل نظاما يستند إلى أن المرحلة السائلة. مثال على نظام المرحلة السائلة المستندة غالبا ما تستخدم في polioresearch 3،4 هو بروتين الصغيرة A-مناعي اختبار 5. على الرغم من هذا الاختبار أثبت تطبيقه، يقتضي وجود FC-هيكل، والذي هو غائب في nanobodies 6،7. ومع ذلك، وفرصة أخرى، ويمكن هذه مثيرة للاهتمام ومستقر واحد نطاق الأجسام المضادة 8 المهندسة بسهولة مع مختلف به. وتستخدم على نطاق واسع (له) 6 علامة يظهر تقارب لأيونات ثنائي التكافؤ مثل الكوبالت والنيكل أو، والتي يمكن عن دورهم تطلى بسهولة على حبات مغناطيسية. ونحن بالتالي وضعت هذه كمية بسيطةتقارب فحص القبض على أساس الخرز الكوبالت المغناطيسي المغلفة. وصفت فيروس شلل الأطفال مع 35 S لتمكين التفاعل دون عوائق مع nanobodies وتقديم كشف كمية ممكنة. الأسلوب السهل القيام بها ويمكن أن تنشأ مع انخفاض التكلفة، والذي تدعمه بمزيد من إمكانية حبات المغناطيسي تجديد بشكل فعال.
Protocol
Discussion
في البروتوكول، يتم تعريف النشاط الإشعاعي للمستضد التفاعل مع nanobody مثل فقدان فيروس radiolabeled من طاف. ولذلك فإن كمية النشاط الاشعاعي عجلت (= 100 – 1٪) ويمكن تقدير (منضمة إلى حبات المغناطيسي) بطريقة غير مباشرة من النشاط الإشعاعي في طاف (= 1٪). من ناحية أخرى، فإنه من الممكن أيضا لقي…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفان بالشكر إلى موظفي إدارة التكنولوجيا الحيوية الصيدلية والبيولوجيا الجزيئية وPelsmacker خصوصا دي مونيك لإعداد هذا الفيروس المسمى المشعة. ونحن ممتنون للميركس إلين وHadewych Halewyck على ملاحظاتهم للاهتمام ومناقشات وBleeser دي جيريت لمساعدته في المختبر. وأيد هذا العمل من الناحية المالية من منحة OZR من جامعة بروكسل الحرة (OZR1807)، وvoor فون Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) ومنظمة الصحة العالمية (TSA 200410791). ليز Schotte زميل predoctoral من voor فون Vlaanderen Onderzoek Wetenschappelijk (FWO).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetic beads |
| Optiphase ‘HiSafe’ 2 | Perkin Elmer | 1200 – 436 | Scintillation fluid |
Riferimenti
- Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
- Meloen, R. H., Briaire, J. A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins. J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).
- Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus. J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).
- Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens. J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).
- Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. a. j. y. a. n. a., Bendahman, E., N, ., Hamers, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).
- Muyldermans, S. Single domain camel antibodies: current status. Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).
- Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. Epitope evolution in poliovirus maturation. Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).
- Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen. Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).
- Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads. J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).
- Wild, D. . The Immunoassay Handbook. , (2005).
- Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis. Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).
- Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER. Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).
