Жидкая фаза Affinity Capture методом с использованием магнитных шариков по изучению белок-белковые взаимодействия: Полиовирус-нанотела Пример
Summary
В этой статье, простой, количественный, жидкая фаза близости захвата анализа представлены. Это надежный метод, основанный на взаимодействии магнитных шариков и меченных белков (например, нанотел), с одной стороны, и близость между помеченные белка, а второй, обозначенный белка (например, вирус полиомиелита), с другой.
Abstract
В этой статье, простой, количественный, жидкая фаза близости захвата анализа представлены. При условии, что один белок может быть помечен и другой белок надписью, этот метод может быть реализован для изучения белок-белковых взаимодействий. Она основана, с одной стороны на признание меченых белков кобальта покрытием магнитных шариков, а с другой стороны по взаимодействию помеченные белка, а второй специфического белка, который маркирован. Во-первых, маркировку и меченных белков перемешивают и выдерживают при комнатной температуре. Магнитные шарики, которые признают тегов, добавляются и связанной фракции меченых белков отделяют от несвязанного фракция с помощью магнитов. Количество меченых белков, которые захватили можно определить косвенным образом путем измерения сигналов меченых белков остается в несвязанной фракции. Описанные жидкой фазы близости анализ чрезвычайно полезен, когда конформационные преобразования чувствительные белки задницуАйед. Разработки и применения анализа показано, для взаимодействия между полиовируса и полиовируса признании нанотел 1. С полиовируса чувствительны к конформационным конвертации 2 при подключении к твердой поверхности (неопубликованные результаты), использование ИФА ограничены и жидкой фазы на основе системы должно быть предпочтительным. Например жидкой фазы система часто используется в polioresearch 3,4 является микро белка-иммунопреципитации тест 5. Хотя этот тест доказал свою применимость, он требует Fc-структура, которая отсутствует в нанотел 6,7. Однако, как еще одна возможность, это интересные и стабильные однодоменных антител 8 может быть легко разработаны с различными тегами. Широко используется (Его) 6-тег показывает сродство к двухвалентных ионов, таких как никель или кобальт, который может на свою очередь, легко нанесенные на магнитные шарики. Поэтому мы разработали этот простой количественныйАнализ близость захвата на основе кобальта покрытием магнитных шариков. Полиовирус был помечен 35 S чтобы беспрепятственного взаимодействия с нанотел и сделать количественное определение возможно. Метод прост в исполнении и могут быть установлены с низкой стоимостью, которая также поддерживается возможность эффективно регенерации магнитных шариков.
Protocol
Discussion
В протоколе, радиоактивность антиген взаимодействует с нанотела определяется как потеря радиоактивно вируса супернатант. Таким образом, количество осажденного радиоактивности (= 100 -%) (привязанный к магнитные шарики) можно оценить косвенным образом на радиоактивность в супернатанте (…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность сотрудникам отдела фармацевтической биотехнологии и молекулярной биологии и, особенно, Моник де Pelsmacker для подготовки радиоактивных меченых вирусов. Мы благодарны Эллен Меркс и Hadewych Halewyck за интересные замечания и обсуждения и Геррит де Bleeser за помощь в лабораторных условиях. Эта работа выполнена при финансовой поддержке гранта OZR из Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), Fonds воор Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) и Всемирная организация здравоохранения (TSA 200 410 791). Лиза Schotte является predoctoral сотрудник Fonds воор Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetic beads |
| Optiphase ‘HiSafe’ 2 | Perkin Elmer | 1200 – 436 | Scintillation fluid |
Riferimenti
- Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
- Meloen, R. H., Briaire, J. A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins. J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).
- Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus. J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).
- Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens. J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).
- Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. a. j. y. a. n. a., Bendahman, E., N, ., Hamers, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).
- Muyldermans, S. Single domain camel antibodies: current status. Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).
- Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. Epitope evolution in poliovirus maturation. Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).
- Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen. Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).
- Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads. J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).
- Wild, D. . The Immunoassay Handbook. , (2005).
- Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis. Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).
- Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER. Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).
