Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek
Summary
Bu makalede, basit, kantitatif, sıvı faz afinitesi yakalama deneyi sunulmuştur. Bu bir yandan, diğer tarafta etiketli protein ve ikinci, etiketli protein (örn. poliovirus) arasındaki yakınlığı manyetik boncuk ve etiketli proteinlerin (örneğin nanobodies) arasındaki etkileşime dayanan güvenilir bir tekniktir.
Abstract
Bu makalede, basit, kantitatif, sıvı faz afinitesi yakalama deneyi sunulmuştur. Bir proteinin etiketlenmiş edilebilir olması şartıyla ve başka protein etiketli, bu yöntem, protein-protein etkileşimlerinin araştırılması için de uygulanabilir. Bu, kobalt kaplı manyetik boncuklar ile etiketlenmiş protein tanınması ile etiketlenmiş protein ve etiketlenmiştir ikinci bir özel protein arasındaki etkileşimi, diğer yandan, bir taraftan dayanır. İlk olarak, etiketlenmiş ve etiketlenmiş proteinleri karıştırılır ve oda sıcaklığında inkübe edilir. Etiketi kabul manyetik boncuk, eklenir ve etiketli protein bağlı fraksiyonu mıknatıslar kullanılarak ilişkisiz fraksiyon ayrılır. Yakalanır etiketli protein miktarı, ilişkisiz fraksiyonu içinde kaldı etiketli protein sinyali ölçülmesi ile dolaylı bir şekilde belirlenebilir. Yapısal dönüşüm duyarlı proteinler eşek olduğunuzda açıklanan sıvı faz afinitesi tayini son derece yararlıayed. Assay of gelişimi ve uygulama poliovirus ve nanobodies 1 tanıyan poliovirus arasındaki etkileşim için gösterilmiştir. Poliovirus katı bir yüzey (yayınlanmamış sonuçlar) eklenmiş konformasyonel dönüşüm 2 karşı hassas olduğu için, ELISA kullanımı sınırlıdır ve bir sıvı faz bazlı sistemi nedenle tercih edilmelidir. Genellikle polioresearch 3,4 kullanılan bir sıvı fazda tabanlı bir sistemin bir örneğini mikro protein A-immünopresipitasyon testi 5 'dir. Bu test uygulanabilirliğini kanıtlamış olsa da, 6,7 nanobodies bulunmaz bir Fc-yapısı gerektirir. Ancak, başka bir fırsat olarak, bu ilginç ve istikrarlı tek alan antikorlar 8 kolayca farklı etiketler ile tasarlanmış olabilir. Yaygın (O'nun) 6-etiketi gibi onların dönüşünü kolaylıkla manyetik boncuk kaplı edilebilir nikel ve kobalt gibi iki değerlikli iyon afinite gösterir kullanılır. Bu nedenle, bu basit kantitatif geliştirdiafinite yakalama testi kobalt kaplı manyetik bilye dayalı. Poliovirüs nanobodies ile engellenmeden etkileşimi etkinleştirebilirsiniz ve nicel bir saptama yapılabilir kılmak için 35 S etiketli edildi. Metodu gerçekleştirmek için kolaydır ve daha etkili bir şekilde yenileyici manyetik boncuklar olasılığını tarafından desteklenen bir düşük maliyet ile tespit edilebilir.
Protocol
Discussion
Protokolde, nanobody ile etkileşen antijen radyoaktivite süpernatan gelen radyoetiketli virüsünün kaybı olarak tanımlanmaktadır. Bu nedenle çöken radyoaktivite (= 100 -%) miktarı (manyetik boncuk bağlı) supernatant (= bir%) olarak radyoaktivite tarafından dolaylı bir şekilde tahmin edilebilir. Diğer taraftan, 500 mM imidazol ile manyetik boncuklar immün elüt tarafından doğrudan bir şekilde antijen çöktürülmüş bağlı fraksiyonun radyoaktivite ölçmek için de mümkündür. Bu, daha önce rad…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar radyoaktif etiketli virüs hazırlanması için Farmasötik Biyoteknoloji ve Moleküler Biyoloji Bölümü ve özellikle Monique De Pelsmacker personeline teşekkür ederim. Biz Ellen Merckx ve onların ilginç açıklamalar ve tartışmalar için Hadewych Halewyck ve laboratuvarda yaptığı yardım Gerrit De Bleeser minnettarız. Bu çalışma, maddi Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) ve Dünya Sağlık Örgütü (TSA 200.410.791) bir OZR hibe ile desteklenmiştir. Lise Schotte Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO) bir predoctoral üyesidir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetic beads |
| Optiphase ‘HiSafe’ 2 | Perkin Elmer | 1200 – 436 | Scintillation fluid |
Riferimenti
- Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
- Meloen, R. H., Briaire, J. A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins. J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).
- Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus. J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).
- Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens. J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).
- Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. a. j. y. a. n. a., Bendahman, E., N, ., Hamers, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).
- Muyldermans, S. Single domain camel antibodies: current status. Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).
- Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. Epitope evolution in poliovirus maturation. Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).
- Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen. Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).
- Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads. J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).
- Wild, D. . The Immunoassay Handbook. , (2005).
- Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis. Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).
- Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER. Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).
