Un liquido fase di cattura test affinità utilizzando biglie magnetiche per studiare interazioni proteina-proteina: il poliovirus-Nanobody Esempio
Summary
In questo articolo, un semplice, quantitativa, liquido affinità saggio fase di cattura è presentato. Si tratta di una tecnica affidabile basato sull'interazione fra perline magnetiche e proteine etichetta (ad esempio nanobodies) da un lato e l'affinità tra la proteina marcata ed una seconda, proteina marcata (poliovirus esempio) dall'altro.
Abstract
In questo articolo, un semplice, quantitativa, liquido affinità saggio fase di cattura è presentato. A condizione che una proteina può essere etichettato e un'altra proteina etichettatura, questo metodo può essere implementato per l'istruttoria delle interazioni proteina-proteina. Esso si basa su un lato sul riconoscimento della proteina marcata con cobalto perline rivestite magnetiche e dall'altro sulla interazione tra la proteina marcata e una seconda proteina specifica che viene etichettato. In primo luogo, le proteine marcate e targhetta vengono miscelati e incubati a temperatura ambiente. Le biglie magnetiche, che riconoscono il comando, vengono aggiunti e la frazione legata di proteina marcata viene separata dalla frazione non legata utilizzando magneti. La quantità di proteina marcata che viene catturata può essere determinato in modo indiretto misurando il segnale della proteina marcata è rimasto nella frazione non legata. La fase di test descritto liquida affinità è estremamente utile quando le proteine di conversione conformazionale sensibili sono assAyed. Lo sviluppo e l'applicazione del test è stata dimostrata per l'interazione tra poliovirus e poliovirus riconoscere nanobodies 1. Poiché poliovirus è sensibile alla conversione conformazionale 2 quando attaccato ad una superficie solida (risultati non pubblicati), l'uso di ELISA è limitato e un sistema di fase liquida a base deve pertanto essere preferito. Un esempio di un sistema di fase liquida a base spesso utilizzati in polioresearch 3,4 è la proteina A micro-immunoprecipitazione test 5. Anche se questo test ha dimostrato la sua applicabilità, esso richiede una struttura-Fc, che è assente nelle nanobodies 6,7. Tuttavia, come un'altra opportunità, questi interessanti e stabile singolo dominio anticorpi 8 può essere facilmente costruito con diversi tag. Il ampiamente utilizzato (His) 6-tag mostra affinità per ioni bivalenti come nichel o cobalto, che possono a loro volta essere facilmente rivestita su biglie magnetiche. Abbiamo quindi sviluppato questo quantitativo semplicecattura saggio di affinità a base di cobalto perline rivestite magnetiche. Poliovirus è stato marcato con 35 S per consentire l'interazione con i nanobodies senza ostacoli e fare una rilevazione quantitativa fattibile. Il metodo è di facile esecuzione e può essere stabilita con un basso costo, che è ulteriormente supportata dalla possibilità di rigenerare efficacemente le biglie magnetiche.
Protocol
Discussion
Nel protocollo, la radioattività dell'antigene interagire con il nanobody è definita come la perdita di virus radiomarcato dal supernatante. Pertanto la quantità di radioattività precipitato (= 100 – uno%) (legato alle biglie magnetiche) può essere stimata in modo indiretto dalla radioattività nel surnatante (= uno%). D'altra parte, è anche possibile misurare la radioattività della frazione legata precipitato di antigene in modo da eluendo degli immunocomplessi dalle perline magnetiche con imidazolo 500 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il personale del dipartimento di Biotecnologie Farmaceutiche e Biologia Molecolare e soprattutto De Monique Pelsmacker per la preparazione del virus radioattivo marcato. Siamo grati a Ellen Merckx e Hadewych Halewyck per le loro osservazioni e discussioni interessanti e di Gerrit De Bleeser per il suo aiuto in laboratorio. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione OZR della Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), il Fonds voor Onderzoek Wetenschappelijk Vlaanderen (G.0168.10N) e l'Organizzazione Mondiale della Sanità (TSA 200.410.791). Lise Schotte è un collega predoctoral del Fonds voor Onderzoek Wetenschappelijk Vlaanderen (FWO).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetic beads |
| Optiphase ‘HiSafe’ 2 | Perkin Elmer | 1200 – 436 | Scintillation fluid |
Riferimenti
- Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
- Meloen, R. H., Briaire, J. A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins. J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).
- Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus. J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).
- Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens. J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).
- Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. a. j. y. a. n. a., Bendahman, E., N, ., Hamers, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).
- Muyldermans, S. Single domain camel antibodies: current status. Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).
- Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. Epitope evolution in poliovirus maturation. Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).
- Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen. Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).
- Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads. J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).
- Wild, D. . The Immunoassay Handbook. , (2005).
- Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis. Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).
- Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER. Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).
