שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody
Summary
במאמר זה, פשוט, כמותי, שלב נוזלי זיקה assay לכידת מוצג. זוהי טכניקה אמין מבוסס על אינטראקציה בין חרוזים מגנטיים החלבונים המתויגים (למשל Nanobodies) מצד אחד, את הזיקה בין חלבון מתויג החלבון השני, שכותרתו (poliovirus למשל) מצד שני.
Abstract
במאמר זה, פשוט, כמותי, שלב נוזלי זיקה assay לכידת מוצג. ובלבד חלבון אחד יכול להיות מתויג חלבון אחר הנקרא, שיטה זו יכולה להיות מיושמת לחקירת אינטראקציות בין חלבונים. היא מבוססת מצד אחד על ההכרה של חלבון מסומן על ידי קובלט חרוזים מגנטיים מצופה ומצד שני על יחסי הגומלין בין חלבון מתויג חלבון מסוים 2, כי הוא מסומן. ראשית, חלבונים שכותרתו מתויג מעורבבים ו מודגרות בטמפרטורת החדר. חרוזים המגנטי, המזהים את תג מתווספות ואת חלק כפות של חלבון הנקרא מופרד חלק מאוגד באמצעות מגנטים. כמות של חלבון הנקרא, כי הוא נתפס ניתן לקבוע באופן עקיף על ידי מדידת אותות של חלבון הנקרא נשאר חלק לא מאוגד. בשלב תיאר נוזל assay זיקה מאוד שימושי כאשר חלבונים המרה קונפורמציה רגישים בתחתעאייד. פיתוח ויישום של assay באה לידי ביטוי לאינטראקציה בין poliovirus ו poliovirus הכרה Nanobodies 1. מאחר שנגיף הפוליו רגיש המרה קונפורמציה 2 כאשר מצורף משטח יציב (תוצאות שלא פורסמו), שימוש ELISA מוגבלת ומערכת שלב נוזלי מבוסס לפיכך יש להעדיף. דוגמה של מערכת השלב נוזלי מבוסס בדרך כלל משתמשים בו polioresearch 3,4 הוא חלבון מיקרו-immunoprecipitation הבדיקה 5. אף על פי בדיקה זו הוכיחה את ישימותה, זה דורש FC-מבנה, אשר נעדרת את Nanobodies 6,7. עם זאת, הזדמנות נוספת, מעניינת ויציבה האלה יחיד תחום נוגדנים 8 יכול להיות מהונדסים בקלות עם תגים שונים. בשימוש נרחב (שלו) 6 תג מראה זיקה יונים דו ערכי, כגון ניקל או קובלט, אשר יכול על לתורם להיות מצופה בקלות על חרוזים מגנטיים. לפיכך, אנו פיתחו את זה כמותית פשוטהלכידת assay זיקה על בסיס קובלט חרוזים מצופים מגנטיים. Poliovirus סומן עם S 35 כדי לאפשר אינטראקציה עם Nanobodies באין מפריע ולעשות גילוי כמותי ריאלי. השיטה קלה לביצוע, ניתן להקים עם עלות נמוכה, אשר נתמך גם על ידי האפשרות של התחדשות ביעילות את החרוזים מגנטיים.
Protocol
Discussion
בפרוטוקול, רדיואקטיביות של אנטיגן אינטראקציה עם Nanobody מוגדר כאובדן של וירוס radiolabeled מ supernatant. לכן כמות רדיואקטיביות זירז (= 100 -%) (חייב את החרוזים מגנטיים) ניתן להעריך בצורה עקיפה על ידי רדיואקטיביות ב supernatant (=%). מצד שני, אפשר גם למדוד את הרדיואקטיביות של חלק כרוך זירז של ה…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לצוות המחלקה לביוטכנולוגיה התרופות לביולוגיה מולקולרית ובמיוחד מוניק דה Pelsmacker להכנת וירוס מסומן רדיואקטיבית. אנו מודים אלן Merckx ו Hadewych Halewyck על דבריו המעניינים שלהם ודיונים וכדי חריט דה Bleeser על עזרתו במעבדה. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי מענק של OZR מהאוניברסיטה Vrije בריסל (OZR1807), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek פלנדריה (G.0168.10N) ואת ארגון הבריאות העולמי (ה-TSA 200410791). ליזה Schotte הוא עמית predoctoral של Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek פלנדריה (FWO).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetic beads |
| Optiphase ‘HiSafe’ 2 | Perkin Elmer | 1200 – 436 | Scintillation fluid |
Riferimenti
- Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
- Meloen, R. H., Briaire, J. A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins. J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).
- Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus. J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).
- Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens. J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).
- Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. a. j. y. a. n. a., Bendahman, E., N, ., Hamers, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).
- Muyldermans, S. Single domain camel antibodies: current status. Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).
- Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. Epitope evolution in poliovirus maturation. Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).
- Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen. Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).
- Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads. J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).
- Wild, D. . The Immunoassay Handbook. , (2005).
- Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis. Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).
- Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER. Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).
