Eine flüssige Phase Affinity Capture Assay Verwendung von magnetischen Kügelchen, um Protein-Protein Interaktion Studie: Das Poliovirus-Nanobody Beispiel
Summary
In diesem Artikel wird eine einfache, quantitative, flüssigen Phase Affinität Capture-Assay vorgestellt. Es ist eine zuverlässige Technik auf der Wechselwirkung zwischen magnetischen Kügelchen und markierten Proteine (zB Nanokörper) einerseits und der Affinität zwischen dem markierten Protein und einem zweiten, markierten Proteins (zB Poliovirus) auf der anderen Seite.
Abstract
In diesem Artikel wird eine einfache, quantitative, flüssigen Phase Affinität Capture-Assay vorgestellt. Vorausgesetzt, dass ein Protein markiert werden kann und ein anderes Protein markiert, kann dieses Verfahren zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen durchgeführt werden. Es wird einerseits auf der Erkenntnis des markierten Proteins durch Kobalt beschichteten magnetischen Kügelchen und auf der anderen Seite auf der Wechselwirkung zwischen dem markierten Proteins und einer zweiten spezifischen Protein, das markiert ist bezogen. Zuerst werden die markierten und markierte Proteine gemischt und bei Raumtemperatur inkubiert. Die magnetischen Perlen, die das Tag zu erkennen, werden zugegeben und der Anteil an gebundenem markierte Protein wird aus der ungebundenen Fraktion mit Hilfe von Magneten getrennt. Die Menge an markiertem Protein, das erfasst werden auf eine indirekte Weise durch Messen des Signals des markierten Proteins blieb in der ungebundenen Fraktion bestimmt werden. Die beschriebene flüssige Phase Affinitätsassay ist extrem nützlich, wenn Konformationsänderung Umwandlung empfindliche Proteine Esel sindAyed. Die Entwicklung und Anwendung des Tests ist für die Interaktion zwischen Poliovirus und Poliovirus erkennen Nanobodies 1 demonstriert. Da Poliovirus ist empfindlich gegenüber Konformationskonversion 2, wenn an einer festen Oberfläche (unveröffentlichte Ergebnisse) befestigt ist, ist die Verwendung von ELISA begrenzt und eine flüssige Phase System sollten bevorzugt werden. Ein Beispiel einer flüssigen Phase System auch an den polioresearch 3,4 verwendet wird, ist die Mikro-Protein A-Immunpräzipitation Test 5. Auch wenn dieser Test seine Anwendbarkeit unter Beweis gestellt hat, bedarf es eines Fc-Struktur, die es in den Nanobodies 6,7 ist. Doch als eine weitere Gelegenheit, lassen sich diese interessante und stabile Single-Domain-Antikörper 8 leicht mit verschiedenen Tags konstruiert werden. Die weit verbreitete (His) 6-Tag Affinität für zweiwertige Ionen, wie Nickel oder Kobalt, das an der Reihe leicht auf magnetischen Kügelchen beschichtet sein zeigt. Wir haben deshalb diese einfache quantitativeAffinität Capture-Assay auf Kobalt beschichteten magnetischen Kügelchen basiert. Poliovirus wurde mit 35 S markiert, um ungehinderten Interaktion mit den Nanobodies ermöglichen und um eine quantitative Erfassung möglich. Das Verfahren ist einfach durchzuführen und kann mit geringen Kosten, die durch die Möglichkeit der wirksamen Regeneration der magnetischen Beads unterstützt wird festgelegt.
Protocol
Discussion
In dem Protokoll wird die Radioaktivität des Antigens Interaktion mit dem Nanobody als Verlust von radioaktiv markiertem Virus aus dem Überstand definiert. Daher ist die Menge des ausgefällten Radioaktivität (= 100 – a%) (gebunden an die magnetischen Beads) in einer indirekten Weise durch die Radioaktivität im Überstand (= a%) geschätzt werden. Auf der anderen Seite ist es auch möglich, die Radioaktivität des gebundenen Fraktion ausgefallene von Antigen in direkter Weise durch Elution der Immunkomplexe von den …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den Mitarbeitern der Abteilung für Pharmazeutische Biotechnologie und Molekularbiologie und insbesondere Monique de Pelsmacker für die Herstellung der radioaktiv markierten Virus. Wir bedanken uns bei Ellen Merckx und Hadewych Halewyck für ihre interessanten Ausführungen und Diskussionen und Gerrit de Bleeser für seine Hilfe im Labor. Diese Arbeit wurde finanziell durch eine OZR Gewährung der Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), dem Fonds voor Vlaanderen Wetenschappelijk Onderzoek (G.0168.10N) und der Weltgesundheitsorganisation (TSA 200410791) unterstützt. Lise Schotte ist ein Promotionsstipendium des Fonds voor Vlaanderen Wetenschappelijk Onderzoek (FWO).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Dynabeads His-Tag Isolation and Pulldown | Invitrogen | 101.03D | Magnetic beads |
| Optiphase ‘HiSafe’ 2 | Perkin Elmer | 1200 – 436 | Scintillation fluid |
Riferimenti
- Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus. Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).
- Meloen, R. H., Briaire, J. A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins. J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).
- Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus. J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).
- Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens. J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).
- Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. a. j. y. a. n. a., Bendahman, E., N, ., Hamers, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).
- Muyldermans, S. Single domain camel antibodies: current status. Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).
- Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. Epitope evolution in poliovirus maturation. Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).
- Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen. Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).
- Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads. J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).
- Wild, D. . The Immunoassay Handbook. , (2005).
- Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis. Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).
- Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER. Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).
