Summary
Wij meten de spanning release in een axon die gedeeltelijk was gelaedeerde met een laser dissector door gelijktijdige krachtspectroscopie meting uitgevoerd op een optisch gevangen probe gehecht aan het membraan van de axon. De ontwikkelde experimentele protocol evalueert de axon hechting aan de cultuur substraat.
Abstract
De vorming van functionele verbindingen in een ontwikkelende neurale netwerk wordt beïnvloed door extrinsieke signalen. De neuriet groei van ontwikkelingslanden neuronen de chemische en mechanische signalen, en de mechanismen die het detecteert en aan mechanische signalen worden slecht begrepen. Ophelderen van de rol van krachten in maturatiemerkers zal de inrichting van steigers die celadhesie en cytoskelet koppeling kunnen bevorderen het substraat en daarom de capaciteit van verschillende neuronale types te regenereren na letsel.
Hier beschrijven we een methode om simultane kracht spectroscopie metingen gelden tijdens laser-geïnduceerde cel laesie. Wij meten spanningsversie in de gedeeltelijk laesie axon door gelijktijdige interferometrische volgen van een optisch gevangen probe gehecht aan het membraan van de axon. Onze experimentele protocol detecteert de spanning release met piconewton gevoeligheid, en de dynamiek van de spanning vrijkomen tenmilliseconde tijdsresolutie. Daarom biedt een hoge-resolutie methode te onderzoeken hoe de mechanische koppeling tussen cellen en substraten gemoduleerd door farmacologische behandeling en / of verschillende mechanische eigenschappen van het substraat kan zijn.
Introduction
Optische microscopie is een van de minder invasieve beeldvormingssysteem beschikbare levende cellen nemen. Bij de exploitatie van effecten zoals straling druk (zoals in optisch pincet 1) of hoge foton flux (zoals in laser dissector 2), werd deze technologie uitgebreid naar nano-manipulatie. De optische imaging-systeem levert een nauwkeurige controle te visualiseren en manipuleren sub cellulaire doelwitten 3. Tegelijkertijd, dankzij de nauwkeurige kalibratie van de geleverde laservermogen optisch gereedschap bereiken of zachte invasieve monster manipulatie met ongekende reproduceerbaarheid.
Verschillende laboratoria geïntegreerd in dezelfde experimentele opstelling, optisch pincet en laser dissector om organellen 4 te versmelten 5 verschillende cellen, of cellen te stimuleren door optisch aangedreven ladingen 6,7 ablatie. Terwijl optische pincetten, na ijking van de optische stijfheid, zorgen voorde controle van de toegepaste kracht naar de cel op een piconewton schaal, kan laser dissectie systemen optische manipulatie, die varieert van membraan foto-incorporatie aan ablatie van enkele organellen of dissectie van sub-cellulaire structuren moduleren. Echter, laser dissectie kalibratie gebaseerd op kwalitatieve beoordeling van het geheel van optische manipulatie ten aanzien van de energie geleverd aan het monster, voornamelijk gebaseerd op het inzicht geeft morfologische veranderingen veroorzaakt aan het monster 8. In de gepresenteerde methode, laten we zien hoe de kracht spectroscopie metingen uit te voeren tijdens de laser axonale dissectie van een zich ontwikkelende neuron, te kwantificeren, op piconewton schaal, de kracht geproduceerd door een veranderde evenwicht in het cytoskelet structuur van een sub-cellulair compartiment 9. Gekweekte neuronen aan het substraat hechten en polariseren tijdens de ontwikkeling. De polarisatie fase optreedt gedurende de eerste vijf dagen in vitro. In fase twee van polarisatie, een van de extrudersing neurieten langer wordt, en het zal differentiëren tot het axon 10 geworden. Axonale rek in reactie op de trekkracht naar de groei kegel is eerder gemodelleerd door Dennerl's model 11. Onlangs heeft dit model uitgebreid 12 om de rol van neurieten hechting aan de extracellulaire matrix substraten omvatten. Deze biofysische model, na experimentele waarnemingen 13 voorgesteld, bleek dat trekkrachten op groeikegel, propageren langs de neuriet, gemoduleerd wordt door focale adhesies aan het substraat. Evenzo, axonale laesie produceert een lokale versie van spanning uitdragen naar de cel lichaam. Zo hebben we voorgesteld dat het meten van dergelijke uitgebracht spanning in een locatie langs de axon tussen de laesie en de cel soma biedt de mogelijkheid om de demping resultaat van onaangetast focale adhesies beoordelen.
We kalibreren noodzakelijke foton-flux van de laser dissector de omvang van het aangedane axonale damag beheersene, van volledige doorsnijding tot gedeeltelijke laesie. Na de kalibratie, herhaalden we gedeeltelijke laesie axons van meerdere neuronen differentiëren en ontwikkelde protocol de spanningspennen kwantificeren, en aldus een kwantitatieve parameter voor de hechting van de axon schatten dat het substraat 14 verkregen.
In dit werk hebben we in detail de ontwikkelde protocol, dat een nauwkeurige experimentele procedure te evalueren en te vergelijken met de gevoeligheid piconewton axonale hechting aan het substraat in verschillende experimentele condities, zoals chemische 14, of verschillende soorten celkweek support vertegenwoordigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Optische Setup
Het gehele optische systeem eerder 15 beschreven. In het kort wordt het optisch pincet systeem gebaseerd op een ytterbium continuous wave (CW) fiber laser die werkt bij 1064 nm (IPG Laser GmbH). Een ruimtelijke licht modulator (SLM) (LCOS-SLM, model X10468-07 - Hamamatsu) varieert de fase van het inkomende IR laserstraal om de positie van de vangst richten plek op de cultuur schotel door de computer gegenereerde hologrammen te controleren. De vrij beschikbare Blue-pincet software (weblink op apparatuur tabel) gegenereerde hologrammen geprojecteerd op de ruimtelijke licht modulator. De interferometer voor kracht-spectroscopie metingen was gebaseerd op een vier-kwadrant fotodiode (QPD, S5980 met C5460SPL 6041 board - Hamamatsu) en een fotodiode (PD, PDA100A-EC - Thorlabs).
De laser dissectie bron een nanoseconde gepulseerde UV Nd: YAG-laser bij 355 nm (PNV-001.525-040, Powerchip nano-Pulse UV laser - Teem Photonics). Een akoestisch-optische modulator (MQ110-A3-UV, 355 nm gesmolten silica-AA-Opto-elektronisch) gecontroleerde het vermogen van de UV laser die aan het monster.
Het holografische optische pincetten en laser micro-dissector geïntegreerd op een gemodificeerde rechtopstaande microscoop (BX51 - Olympus) uitgerust met een 60x NA 0,9 water dompelen objective.The stadium van de microscoop bestaat uit een 3-assige lineaire gelijkstroommotor micro-positionering systeem (M-126.CG1, natuurkunde-instrumenten) die een aparte 3-assige piëzo-elektrische nano-positionering stage (P-733.3DD, natuurkunde-instrumenten) tot grof beweging van het monster te combineren met de sub-nanometer resolutie van de piëzo- podium. De microscoop traps systeem was uitgerust met twee regelkringen synergetisch optreden om de vangst scherpstelling plaatse handhaven op de juiste positie, afhankelijk van de geselecteerde werkmodus (positie of force clamp, statisch of dynamisch) 16. Vooral intern terugkoppellus werkt op een piëzo stadium de hiel houden een selected afstand van de val centrum. De andere uitwendige lus regelt de positie van de gemotoriseerde fase het gebied overspannen door de piëzo-actuator op een groter gebied dan de beschikbare slag 17 benutten. Wanneer het piëzo-fase de grenzen van de beschikbare slag in een richting bereikt, de externe lus verplaatst de micro fase in de tegengestelde richting, waardoor de piëzo herstelt naar zijn centrale positie, omdat het volgen van de gevangen kraal gehecht aan het monster. Wanneer het piëzo-fase de centrale positie van het natuurlijk bereik bereikt, de micro fase gestopt. Verdere details van het systeem worden gemeld in Guiggiani et al. 16,17.
Een Peltier-apparaat (QE1 weerstandsverwarmingsbronnen met TC-344B dual channel zonneboiler controller - Warner Instruments) regelt de temperatuur van de celkweek onder de microscoop (37 ° C). In de cultuur, werden de pH en de luchtvochtigheid bij fysiologische omstandigheden onderhouden door beluchten van een op maat ontworpen polydimethylsiloxane (PDMS) huls (de microscoop doelstelling integreren) met bevochtigde carbogen (95% O 2, 5% CO 2).
2. Cel Cultuur Voorbereiding
Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid. Primaire kweken werden verkregen uit hippocampus van muizen (C57BL6J, Charles River) op embryonale dag 18 (E18).
- Neuronen werden met een concentratie van 25.000 cellen / ml op glazen bodem petrischalen (P35G-0-14-C - MATEK Corporation). De lage concentratie van gekweekte cellen is nodig om de vorming van een dicht netwerk reeds in de eerste dagen in vitro te voorkomen. Bij de genoemde celconcentratie, de kans op het vinden geïsoleerde cellen met een langere neurieten niet met andere cellen is veel hoger.
3. Kraal Coating
- Polymere microsferen (Ø 4 micrometer, COOH-opgezegd-Bangs Laboratories, productcode PC05N/6700) werden bekleed met poly-D-lysine aanleiding van de in de Polylink Protein Koppeling Kit (Polysciences, productcode 19539) beschreven procedure. De kralen zijn bekleed met hetzelfde molecuul gebruikt voor de kweek steun en ondernemer cellen hechting omvatten.
4. Kies Geïsoleerde Neuron. Los Een Kraal van het Cultuur Ondergrond, Trap en Move it Naast de Neuron
- Zet de cultuur petrischaal op de microscoop podium. Na het instellen van de focus op het monster door het podium beweging, corrigeer de positie van het lichtdoorlatende doelstelling condensor aan Kohler-verlichting in te stellen. Het uitlijnen van de verlichting optiek om de conditie Kolher-belichting ingesteld is nodig om het helder veld beeldkwaliteit te verbeteren. Het gebruik van dergelijke harmonisatievoorwaarden is het ook noodzakelijk de IR laser verzamelingsrendement (via doelstelling condensor) maximaliseren van de verstrooiing gevangen sonde zijn interferometrische volgen nakoming door QPD en PD.
- Pipetteer een paar ul van de beklede microsfeer voorraadoplossing inaan de cultuur schotel. Microsferen zal storten en zich houden aan de cultuur substraat. Het aantal pl geïnjecteerd in de kweekschaal afhankelijk van de microsfeer concentratie van de voorraadoplossing. De optimale mogelijkheid is om een tot twee microbolletjes per beeldvorming gezichtsveld. Wanneer er te veel microsferen toegevoegd aan de kweekschaal, kunnen zij reeds willekeurig hechten aan de gekweekte neuronen.
- Bewegen in de cultuur schotel, op zoek naar een geïsoleerde neuron met een langere neuriet (het axon), en sla de positie van de microscoop podium.
- Bewegen en zoeken naar een kraal gehecht aan de cultuur ondersteunen.
- Schakel de IR-trapping laser. In dit stadium worden geen hologrammen geprojecteerd op SLM, en de positie van de IR laser spot samenvalt met de UV laserspot positie. Stel de axiale positie van de IR spot 2-3 urn boven het steunvlak cultuur, door microscoop podium beweging.
- Stel de UV laser afgegeven vermogen om het monster tot minder dan 1 μW. DeUV laser dissector eerder is gekalibreerd 14:
5-6 μW de glazen steun wordt weggenomen
4 μW een neurale verbinding volledig ontleed
2,5 μW een neuriet gedeeltelijk laesie
<1 μW een schokgolf wordt geproduceerd in de cultuur schotel. De optische schokgolf is sterk genoeg om de hiel los van de glazen drager. - Schakel de UV-laser, terwijl de IR laser op, en verplaats de UV plek boven de kraal gehandeld door microscoop podium beweging. De kraal loslaat van het oppervlak, en wordt gevangen door de IR laser. Schakel dan de UV-laser.
- Verplaats de gevangen kraal verschillende micrometers boven het glas ondersteuning (20-30 micrometer). Opheffing van de kraal deze positie wordt voorkomen dat contact met andere cellen, terwijl deze wordt bewogen naar het eerder gekozen neuron. Breng de kraal naar de eerder opgeslagen podium positie. Stel de fase snelheid op een lage waarde (10 um / sec), zodat de luchtweerstand vloeistof kracht niet groter is dan de optische valping kracht.
5. Verplaats de Trap positie ten opzichte van de Laser Dissector Spot en Axon standpunt door Computer Generated Hologram, en kalibreren de optische pincet Stijfheid
- Verplaats de kraal naar de glazen steun aan de axon te visualiseren. De kraal is boven de cel gehouden om contact te vermijden met het (ongeveer 5 micrometer boven het glas ondersteuning).
- Verplaats de microscooptafel de UV richten spot verplaatst op het midden van de breedte van de axon. Sla de huidige fase positie.
- Verplaats de IR scherpstelling contante positie door de computer gegenereerde hologram. In deze stap wordt de stap stopgezet in de gekozen positie van de vorige stap. Als de computer gegenereerd hologram wordt geprojecteerd op de SLM wordt de gevangen kraal bewogen ten opzichte van de axon. We gaan de IR laser spot om de gevangen kraal gericht op het midden van de neurieten, met UV laser spot gecentreerd op dezelfde neurieten ook. De IR plek en dus de gevangen kraal zijn langs de neurieten5-10 um weg van de UV-spot. We gaan de positie van de IR met betrekking tot de UV spot naargelang de neurieten geometrie. Indien de optische pincet zijn niet voorzien van een SLM-systeem, kan de positie worden gevarieerd door kantelen spiegels, optische of akoestische deflectors, de IR optische pad. De IR laser spot kan worden gepositioneerd 5-10 um weg van de UV plek om optische interactie van het ontleden bundel met de gevangen sonde, die de Brownse beweging kunnen beïnvloeden en veranderen de kracht spectroscopie sporen te voorkomen.
- Na het definiëren van de nieuwe IR contante positie met betrekking tot UV-spot en axon staat, zet het podium om uit de buurt van het axon positioneren de gevangen kraal en botsing met het te vermijden. Verplaats de axiale positie van de gevangen kraal tot ongeveer 2 urn boven het dekglas.
- Lijn de QPD te midden van de interferentiestrepen erop: x en y QPD differentiële signalen zijn nullen als de QPD wordt gecentreerd. Verwerven 5 sec van de Brownse beweging van de gevangen kraal door de interferometer, bij 50 KHz sampling rate. Haal de stijfheid (pN / nm) en gevoeligheid (V / nm) van de optische val van het vermogensspectrum methode 18.
6. Bevestig de Kraal aan de Axon. Voer axotomy en Gelijktijdige Force Measurement
- Til de gevangen kraal positie ongeveer 4 micrometer boven het deksel glas, en verplaats het naar de eerder opgeslagen podium positie (zie stap 3.2).
- Verplaats de gevangen kraal naar beneden richting het axon totdat hij de neuriet. De botsing tussen de gevangen kraal en axon wordt door de z QPD signaal detecteren van verplaatsing van de gevangen kraal in de axiale richting.
- Wacht 10 sec met de gevangen kraal duwde tegen de axon naar zijn hechting gunst aan de neuriet membraan.
- Verplaats de micro stadium de gevangen kraal uit de axon verplaatsen, en daarmee de adhesie te verifiëren op het celmembraan. Als de kraal gehandeld, het ontsnapt uit de optische val.
- Terug Verplaats de laser val op de aangehouden beaden schakel de kracht-klem lus met kracht conditie gelijk aan nul. Op een dergelijke wijze, de piëzo-fase herpositioneert de kraal, aan de cel, op het optische val centrum. Als het systeem niet over een feedback loop control, kan de laser val positie verplaatst worden door de microscoop podium te centreren op de aangehechte sonde. Het centrum van de val wordt bereikt wanneer de QPD signalen hetzelfde als wanneer de hiel wordt opgesloten en niet gehecht aan de cel (x en y QPD signalen gelijk aan nul, en z QPD signaal geeft dezelfde spanning som van de vier kwadranten zoals wanneer de hiel ver is gevangen vanaf elk oppervlak).
- Stel een kracht-klem staat op de z-as, het positioneren van de laser trapping iets boven het midden van de kraal (ongeveer 100 nm), een voorspanning op de gehechte gevangen probe genereren. Indien het systeem niet is uitgerust met een kracht-clamp control, kan de optische val stand worden opgewekt in de stappen van 25 nm door de microscoop podium. De z QPD signaal zorgt voor de opvolging. Gebruik daarom this signaal de positie van de laser valstrik met betrekking tot de probe gehecht. Dergelijke voorspanning nodig om de druk op het membraan na de axonale laesie en de daaruit voortvloeiende verlaging van de Brownse beweging van de probe gehecht voelen. Een vergelijkbare benadering voorgesteld om het meten van de afgifte van de spanning in een membraan ketting door video imaging 19.
- Uitschakeling van de force-feedback klem om de werking op de aangehechte sonde in de stand-klem conditie (de piëzo-stadium wordt geblokkeerd) te meten.
- Start gelijktijdig opnemen van de gevangen sonde posities door de interferometer (20 KHz sampling-frequentie), en de cel tijdens laser axotomy time-lapse-bright-field imaging (20 Hz beeldfrequentie).
- Schakel de UV-laser om laserpulsen leveren tot een laesie zichtbaar op het beeld van de axon (gewoonlijk 200-400 optische pulsen nodig Energie per puls.: 25 nJ) wordt, dan schakelt u de UV laser.
- Doorgaan met opnemen door de interferometer voor ongeveer 3 kmn, totdat de x, y en z QPD sporen vervlakken.
7. Kwantificeren van de Total spanningspennen
- Zet de opgenomen QPD sporen (in Volt) van de gekalibreerde gevoeligheid van de optische val, de respectieve sporen in nanometers verkrijgen.
- Filter de x, y en z verplaatsing sporen door een high-pass filter met afgesneden bij 10 Hz.
- Bereken de totale variantie van de gefilterde sporen die de Brownse beweging van de gevangen kraal. Bereken de variantie op 25 msec stappen voor overlappende tijdvensters van 500 msec (10.000 datapunten) 20. De hoogdoorlaatfiltering van sporen sluit de veranderingen van de Brownse beweging als gevolg van het membraan fluctuatie of corticale actine beweging. De Brownse beweging van de hiel wordt verminderd door de optische krachten en adhesie krachten op de celmembraan. Wanneer het membraan wordt gespannen door het bezorgen van spanning de viscositeit toeneemt en waardoor de Brownse beweging van de kraal, gedetecteerd onmidlijk na axotomy, begint te dalen.
- Definieer t0: het begin van de daling van de Brownse beweging variantie, na de levering van UV laserenergie. Het moment t0 geeft het begin van membraan stam.
- Definieer t1: het einde van de daling van de Brownse beweging variantie (als het een plateau bereikt). Het tijdsstip t1 geeft het einde van membraan stam.
- Voer video volgen van puin of een kras op de cover glas ondersteuning, om eventuele drift van het monster tijdens het meten van de kracht te meten. Om het deeltje op het glas ondersteuning bijhouden, we eerst drempels gelden voor de bright-field beelden, een stapel van binaire beelden te verkrijgen met het deeltje in het wit op een zwarte achtergrond. Daarna volgen we het deeltje centrum van de massa met sub-pixel nauwkeurigheid (met behulp van de freeware software ImageJ).
- Trek de gemeten drift door de verplaatsing QPD sporen. Vermenigvuldig de drift-gecorrigeerde QPD sporen door de respectieve gekalibreerde optische stijfheid (k x, k
- Bereken de totale kracht trace als F tot = √ (Fx 2 + Fy 2 + Fz 2).
- Bereken de totale uitstoot van kracht tussen t0 en t1 als F vrijgegeven = F tot (t1) - F tot (t0). De gemeten kracht bij t0 worden afgetrokken omdat het door de verplaatsing van de voeler de val centrum, wanneer de hiel zich aan de neurieten.
- Bereken de neuriet contactoppervlak tussen de gevangen kraal en de UV laser contante positie: op het heldere beeldveld maatregel de lange (L) en korte (D) assen van de neuriet tussen de gevangen kraal en de UV laser contante positie. Het axon contactoppervlak is een axon = L x D.
- Normaliseren van de totale vrijgegeven kracht F vrijgegeven door het axon contactoppervlak Een axon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De cel genereert trekkrachten op het substraat door de focale adhesies. Kracht die door cytoskeletelementen in evenwicht met de tegenwerkende kracht van het kweeksubstraat. Na laser geïnduceerde beschadiging van de neurieten, sommige van de kabels gespannen cytoskelet verstoord evenwicht en hun spanning wordt weggenomen omdat de tegenkracht van het substraat hechting wordt geëlimineerd. De spanning wordt vrijgegeven gedeeltelijk verspreid op het resterende focale adhesies en de hiel aan de celmembraan, die in een optische val, meet het gedeelte van dergelijke release geneutraliseerd door cytoskeletelementen verankeren de cel om het substraat (zie schema fig. 1) .
Wij rapporteren, in figuur 2, een representatief resultaat van de hierboven beschreven experimentele protocol. De neuron in figuur 2a linkerpaneel toont een langere neuriet, die het axon van de onderscheidende n identificeerteuron. In Figuur 2a rechter paneel, wordt hetzelfde neuron getoond na de geïnduceerde axonale laesie (aangegeven door de witte pijl). Figuur 2b toont de opgenomen kraal verplaatsing sporen in x, y, en z-richtingen. Figuur 2c meldt de video volgen van een kras de glazen drager, om rekening te houden en elimineren de fase drift tijdens de meting.
In figuur 3a, op het linker paneel, tonen we de laesie neuriet, en de witte lijn stroomopwaarts de laesie site, waar we berekenen de kymograaf van de neuriet diameter tijdens de spanningsversie meting. Het rechtervenster de kymograaf, nader neurieten diameter enigszins toe onmiddellijk na de laesie, en dunner als gevolg van het vrijkomen van de spanning naar de cel soma. In figuur 3b, kwantificeren we de kymograaf resultaat. De neuriet helderder lijkt ten opzichte van de achtergrond, omdat we de positie attaschakeld kraal in de focus midden van het doel, en dus de axon is enigszins onscherp. Sterker nog, door de rapportage van de som van de pixel intensiteiten langs de kymograaf lijn bij elk frame van de time-lapse video-opname, een schatting van de neuriet diameter krijgen we tijdens de release van spanning. Op paneel 3c, melden wij het totale variantie van de bijgevoegde kraal tijdens de spanning release, berekend op basis van de sporen opgenomen door de interferometer (in figuur 2b) na hoogdoorlaatfiltering bij 10 Hz cut-off frequentie. We kunnen zien dat de variantie toeneemt met de diameter neurieten in ophoping van materiaal stroomopwaarts van de laesie. Vervolgens wordt de variantie begint dalen (bij t0 in figuur 3c) wanneer het membraan is gespannen en de neurieten diameter afneemt ook. De variantie daling bereikt een plateau (op t1 in figuur 3c), wanneer de spanning vrijlating ophoudt. Na t1 is de Brownse beweging begint te stijgen omdatvan membraan ontspanning mogelijk als gevolg van exocytose 21 (zie figuur 3c).
In figuur 4a, het witte vakje geeft de schatting van de neuriet contactoppervlak Een axon met de cultuur ondersteunen. Een axon wordt berekend tussen de UV laser contante positie en het centrum van de gevangen probe. Figuur 4b verslagen de amplitude curve van de totale kracht F vrijgegeven vrijgegeven verkregen na drift gecorrigeerde QPD verplaatsing sporen (figuur 2b) van de respectieve gekalibreerde vermenigvuldigen optische val stijfheid (kx, ky, kz). We berekenen het verschil tussen de kracht gemeten op tijdstip t1 en t0 (ΔpN in figuur 4b), en dan gaan we delen door een axon, om de spanning uitgebracht in termen van pN / um 2 te verkrijgen.
Door het herhalen van hetzelfde protocol op verschillende neuronen in de steekproef, kunnen we beginnensessies experimenten verschillende culturen behandeld met chemische factoren of uitgeplaat op verschillende dragers, en tenslotte de gemiddelde waarde in de verschillende experimentele omstandigheden te vergelijken. In fig. 5 tonen we de vrijlating van spanning na axonaal letsel wordt gedempt door focale adhesies op het substraat, waardoor een hogere spanningsversie waarde: een axon minder aan het substraat gehecht. Omdat we induceren een gedeeltelijke en niet volledig, letsel van axon, onderzochten we de afhankelijkheid van de gemeten spanning release op de totale geleverde energie en de neurieten contactgebied tussen de laesie en de gevangen kraal. We wilden meer cytoskeletelementen vernietigen door het leveren van een groter aantal van lichtpulsen, en derhalve leiden tot een hogere afgifte van spanning. Anders, met een verhoogde neuriet contactoppervlak, verwachtten we een lagere hoeveelheid spanning vrijlating te meten. In Figuur 5 wordt aangetoond dat de afhankelijkheid van de twee bovengenoemde parametersniet duidelijk. , Waaruit we dat de geïnduceerde gedeeltelijke laesie (met de eerder berekende lage energie per puls, zie protocol stap 4,5), is gerelateerd aan de afmeting van het ablatie vlek 8, die niet varieert bij gebruik van hetzelfde microscoopobjectief en dezelfde energie per puls op het monster. Het feit dat het vrijkomen van de spanning niet is gecorreleerd aan het contactoppervlak is niet verrassend omdat het bekend is dat deze parameters niet die een inschatting van de celadhesie aan het substraat, als focale adhesies bezetten slechts 1% van de basisoppervlak 22.
Figuur 1. Grafische weergave van de verstoorde cytoskelet evenwicht tijdens laser axotomy. Een cel hecht aan een substraat door focale adhesies. Blauwe pijlen specify tractie krachten die ontstaan door cytoskeletelementen (aangegeven met veren). Licht-blauwe pijlen geven de tegenwerkende krachten die ontstaan door de rigide cultuur substraat. In een vereenvoudigde scenario voor laesie, de cytoskelet en substraat krachten gekoppeld en geëquilibreerd. Na de laser-geïnduceerde laesies van de neuriet, worden de verbindingen tussen een aantal veren en de ondergrond verstoord. Aldus is het substraat niet meer het tegengaan van de trekkracht van de cytoskletal element. De gevangen kraal, aan membraan, volgt de richting van de vrijgemaakte cytoskelet krachten.
Figuur 2. Interferometrische volgen van het gevangen kraal, bevestigd aan het membraan van de axon van hippocampale neuron tijdens laser geïnduceerde laesie. (A) Helderveld beelden verworven tijdens ablatie van een axon. Voordat de laesie op het linker paneel. Nadat de laesie op het rechterpaneel. Een poly-D-lysine beklede kraal is bevestigd aan het membraan (polystirene kraal Ø 4 urn) en bewaard in een optische val. Gemiddeld vermogen van de IR laser op het monster 14 mW. Witte pijl geeft de laesie. Bar is 5 micrometer. (B) Opgenomen sporen door back focal plane interferometrie van de hiel positie in de optische val. Blauw, groen en rood sporen geven de kraal positie langs x, y en z-assen. Bemonsteringsfrequentie is 20 kHz. (C) Verplaatsing van een kras op de cultuur steun gemeten door video-tracking op het podium drift te controleren. Blauw en groen sporen zijn de x-en y-posities verkregen door video-tracking. Frame rate is 5.5 Hz.
77fig3.jpg "/>
Figuur 3. Analyse van het axon diameter tijdens de spanning release, en het membraan stam van de gelaedeerde axon. (A) Bright beeldveld van de laesie axon, op het linkerpaneel. De witte lijn loodrecht op de axon geeft de positie waar een kymograaf wordt berekend. Op het rechter paneel, kymograaf van het axon diameter, stroomopwaarts van de laesie. Elke rij van de kymograaf overeen met 0.18 sec. (B) Totaal pixel intensiteiten van elke rij van de kymograaf vertegenwoordigt een schatting van de axon diameter tijdens de spanningspennen. (C) Totaal variantie van de Brownse beweging van de hiel aan de axon (t0 en t1 geven respectievelijk het begin en het einde van spanning release in het axon na dissectie).
0477/50477fig4.jpg "/>
Figuur 4. Kwantificering van de spanning vrijgegeven na axotomy. (A) Bright beeldveld van de laesie axon. De witte doos geeft de schatting van de neuriet contactoppervlak tussen de laesie en het centrum van de gevangen kraal. (B) Trace van de totale amplitude van de gemeten kracht na axotomy (F tot = √ (Fx 2 + Fy 2 + Fz 2)). Fx, Fy en Fz werden berekend door de wet van Hooke (F = kx), waarbij de verplaatsing sporen zijn de in figuur 2b die. De stijfheid in de drie orthogonale richtingen van de optische val werden berekend door het vermogensspectrum methode (k x, y = 7,9 pN / um, k z = pN 2,3 / um). ΔpN geeft de gemeten vrijgegeven kracht tussen de tijdstippen t0 en t1.
Figuur 5. Afhankelijkheid van de gemeten spanning release op de hoeveelheid energie geleverd aan het monster, en op de neuriet contactoppervlak. Gegevens van 26 experimenten uitgevoerd op de axonen van de muis hippocamapal neuronen op 3 DIV. (A) Scatter plot van spanningsversie versus neurite contactvlak tussen laesie en gevangen kraal locaties. (b) Scatter plot van spanningsversie versus totale hoeveelheid energie geleverd aan het monster neuriet contactoppervlak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij rapporteren in dit werk een kwantitatieve methode om de neuriet hechting te vergelijken met de cultuur substraat, door het uitvoeren van gelijktijdige kracht spectroscopie meting tijdens laser-geïnduceerde cel laesie. De gemeten afgifte van spanning gerelateerd aan de mate van hechting van de cellen aan het substraat: cellen met een hoger aantal focale adhesies zou minder spanning los. Het meten van de release van spanning in termen van picoNewtons biedt een fysieke hoeveelheid waarmee de axonale hechting in verschillende experimentele condities 14 evalueren aan de cultuur ondersteunen.
Verschillende laboratoria geïntegreerd een laser preparator met een optisch pincet systeem, de vaststelling van verschillende optische ontwerpen 23. Onze keuze was een opstelling met vaste optische pad en microscoop podium beweging. Hiervoor introduceren we een ruimtelijke lichtmodulator in de UV laserstraal pad naar de vangst spot bewegen ten opzichte van de UV laser positie. Hoewel galvanometric spiegels laten sturen van de laserfocus positie zonder het verplaatsen van de steekproef, kunnen ze mechanisch geluid te introduceren in het systeem die de kracht spectroscopie metingen. Bovendien, hebben we besloten om opnieuw de positie van de IR laser focus op de steekproef, omdat Brownse beweging analyse maakt een snelle herijking van de optische stijfheid. Verplaatsen UV laserspot positie op het monster kan produceren sferische aberraties die de kwaliteit van de UV scherpstelling plek zelf verwaarloosbare alleen voor kleine verplaatsingen van de bundel vanuit de middenstand. Daarom kan modificatie van de optische eigenschappen van de laser dissector een de novo kalibratie van de geleverde laservermogen versus schade aan de entiteit.
Door kracht spectroscopie meting, konden we vaststellen dat de spanning vrijlating is samengesteld uit een snelle fase van een paar seconden, en een langzame fase die enkele tientallen seconden kan duren. Zoals in voorgaande werk 14, soms traagfase kan enkele minuten duren. Om die reden, moesten we de kracht meting door video volgen van een kras op de cultuur ondersteunen corrigeren. In de toekomst zou een betere aanpak zijn om het podium drift te annuleren met een feedback loop, die automatisch corrigeert de microscoop podium positie van video of interferometrische volgen van een kraal aan de dekking van glas. Dit type configuratie reeds gerapporteerd in de literatuur, is een tweede laserstraal gericht op de bijgevoegde kraal, en zorgt podium stabilisatie sub-nanometer precisie 24,25.
In de toekomst, willen we de ontwikkelde protocol toepassing op de axonale hechting vergelijken met de cultuur steun in verschillende stadia van differentiatie en in verschillende pathologische aandoeningen een kwantitatieve assay voor farmacologische behandeling. Bovendien kan hetzelfde protocol toepassing op het ontwerp van implanteerbare scaffolds, de neuronale adhesie te vergelijken verschillende materialen met verschillende mechnische of chemische eigenschappen 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Alberto Guiggiani voor het ontwikkelen van de real-time besturingssysteem, Evelina Chieregatti en Hanako Tsushima voor inzichtelijke discussies, Giacomo Pruzzo en Alessandro Parodi voor de ontwikkeling van aangepaste elektronica en software, en Claudia Chiabrera en Marina Nanni voor hun deskundig advies en bijstand in celcultuur voorbereiding.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | Hamamatsu | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop | ||
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
- Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
- Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).
- Stiess, M., Maghelli, N., et al. Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation. Science. 327, 704-707 (2010).
- Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap. Cytometry. 12, 505-510 (1991).
- Pinato, G., Raffaelli, T., D'Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells. J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).
- Kress, H., Park, J. G., et al. Cell stimulation with optically manipulated microsources. Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).
- Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
- Difato, F., Dal, M. M., et al. Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks. Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- O'Toole, M., Miller, K. E. The role of stretching in slow axonal transport. Biophys. J. 100, 351-360 (2011).
- O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).
- Difato, F., Tsushima, H., et al. The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF. Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).
- Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks. International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).
- Guiggiani, A., Torre, B., et al. Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers. Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).
- Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. 3rd Real Time Linux Workshop. , (2011).
- Neuman, K. C., Block, S. M.
- Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair. Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).
- Kress, H., Stelzer, E. H., et al. Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).
- Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope. Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).
- Carter, A. R., King, G. M., et al. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review. Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).
