Summary
Biz kısmen akson zarı yapışık bir optik-tuzak prob yapılan eş zamanlı kuvvet spektroskopisi ölçümü ile bir lazer disektör ile lezyonlanmıştır olan bir akson gerginlik serbest ölçtük. Geliştirilen Deneysel protokol, kültür alt tabakaya yapışma akson değerlendirir.
Abstract
Gelişmekte olan bir nöronal ağ işlevsel bağlantı oluşumu dışsal kuyrukları tarafından etkilenir. Gelişmekte olan nöronların neurite büyüme kimyasal ve mekanik sinyalleri tabidir ve mekanizmaları hangi mekanik sinyallere algıladığında ve cevap tam olarak anlaşılamamıştır. Hücre olgunlaşmasında güçlerin rolü nedenlerine açıklık yüzeye hücre yapışması ve iskelet bağlantı teşvik iskelelerinin tasarım sağlamak ve bu nedenle yaralanma sonrası yeniden oluşturmak için farklı nöronal türleri kapasitesini artıracaktır.
Burada, lazer kaynaklı hücre lezyon sırasında aynı anda yürürlüğe spektroskopi ölçümleri uygulamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz akson zarı yapışık bir optik tuzak prob aynı anda İnterferometrik izleme tarafından kısmen lezyonlu akson gerginlik serbest ölçün. Bizim deneysel protokol piconewton hassasiyetle gerginlik serbest algılar, ve de gerginlik sürümü dinamikmilisaniye zaman çözünürlüğü. Bu nedenle, bu hücreler ve alt tabakalar arasında, mekanik bağlantı farmakolojik tedavisi ve / ya da ayrı bir alt-tabakanın mekanik özellikleri ile modüle edilebilir nasıl çalışma için yüksek çözünürlüklü bir yöntem sunmaktadır.
Introduction
Optik mikroskop canlı hücrelerin gözlemlemek için kullanılabilir daha az invazif görüntüleme sistemi biridir. Bu radyasyon basıncı (optik cımbız 1 gibi), ya da yüksek enerjili foton akı (lazer ayrıştırıcısındaki 2 gibi) gibi etkileri sömürü ile, bu teknoloji nano-manipülasyon şekilde genişletildi. Optik görüntüleme sistemi 3 görselleştirmek ve alt hücresel hedefleri işlemek için bir hassas kontrol vermektedir. Aynı zamanda, teslim lazer gücünün doğru kalibrasyon sayesinde, optik araçlar görülmemiş tekrarlanabilirlik ile ya yumuşak veya invaziv örnek manipülasyon gerçekleştirmek.
Çeşitli laboratuarlar farklı hücreler 5 araya kaynaştırmak için, ya da optik tahrik kargolar 6,7 ile hücreleri uyarmak için organeller 4, baskılamak için aynı deney düzeneği, optik cımbız ve lazer ayrıştırıcısındaki, entegre. Optik cımbız, optik sertlik kalibrasyon sonra, izin süreBir piconewton ölçekte hücreye uygulanan kuvvetin kontrolü, lazer diseksiyon sistemleri membran fotoğraf poration gelen alt hücresel yapılar tek organel veya diseksiyon ablasyonu arasında değişmektedir optik manipülasyon, modüle olabilir. Ancak, lazer diseksiyon kalibrasyon ağırlıklı olarak örnek 8 neden morfolojik değişiklikler gösteren görüntü analizi dayalı örnek teslim enerji, göre optik manipülasyon işletmenin nitel değerlendirme gerektirir. Sunulan yöntemde, biz piconewton ölçekte, ölçmek için, gelişmekte olan bir nöronun lazer aksonal diseksiyonu sırasında kuvvet spektroskopisi ölçüm gerçekleştirmek için nasıl göstermek, bir alt hücresel bölmesi 9 hücre iskeleti yapısında bir değişmiş denge ile üretilen güç. Kültür nöronlar yüzeye bağlı ve gelişimi sırasında polarize. Polarizasyon faz in vitro ilk beş gün içinde ortaya çıkar. Aşamada polarizasyon iki ekstrüzyon preslerinin birineing neurites daha uzun olur ve bu akson 10 olmak ayırt edecektir. Büyüme konisi de çekme kuvveti yanıt olarak aksonal uzama daha önce Dennerl modeli 11 ile modellenmiştir. Son zamanlarda, bu model hücre dışı matriks yüzeylere nörit yapışma rolünü içerecek şekilde 12 genişletilmiştir. Deneysel gözlemler 13 sonra önerilen Bu biyofiziksel modeli,,, nörit boyunca yayılan, büyüme konisi üzerinde kuvvetleri çekerek yüzeye odak yapışıklıklar modüle olduğunu göstermiştir. Aynı şekilde, aksonal lezyon hücre gövdesi doğru yayılan gerilim yerel bir sürümü üretir. Böylece, lezyon ve hücre soma arasındaki akson boyunca bir yerde bu tür serbest gerilim ölçme etkilenmemiş odak yapışıklıklar nemlendirme sonucu değerlendirmek için imkan sunuyor önerdi.
Biz açtığı aksonal damag ölçüde kontrol etmek için gerekli olan enerji lazer ayrıştırıcısındaki foton akısı-kalibree, tam transeksiyonu kısmi lezyona. Kalibrasyon takiben, bir çok ayırt nöronun akson kısmi lezyon tekrarlandı ve gerilim serbest ölçmek için protokol geliştirilmiş ve böylece alt tabaka 14 için akson yapışma tahmin etmek için bir sayısal parametre elde edilmiştir.
Bu çalışmada, ayrıntılı olarak, kimyasal muamele 14 ya da hücre kültürü destek farklı tipleri gibi farklı deney koşullarında substrata yapışma aksonal değerlendirmek ve piconewton duyarlılığı ile karşılaştırmak için kesin bir deney prosedürü gösteren geliştirilmiş protokolünü açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Optik Kurulumu
Tüm optik sistem daha önce 15 tanımlanmıştır. Kısaca, optik cımbız sistemi 1064 nm (IPG Laser GmbH) bir iterbiyum sürekli dalga (CW) fiber lazer işletim dayanmaktadır. Bir mekansal ışık modülatör (SLM) (LCOS-SLM, modeli X10468-07 - Hamamatsu) bilgisayar oluşturulan hologramlar tarafından kültür çanak yakalama odak nokta konumunu kontrol etmek için gelen IR lazer ışınının faz değişir. Serbestçe kullanılabilir Mavi-cımbız yazılım (ekipman masaya web bağlantısı) üretilen hologramlar mekansal ışık modülatör yansıtılan. Ve bir fotodiyot (PD, PDA100A-EC - Thorlabs) - force spektroskopisi ölçümleri için interferometre dört kadran fotodiyot (Hamamatsu C5460SPL 6041 kurulu ile QPD, S5980) dayanıyordu.
355 nm (- Teem Fotonik PNV-001525-040, Powerchip'in nano-Pulse UV lazer) de: YAG lazer lazer diseksiyon kaynağı darbeli alt nanosaniye UV Nd oldu. Bir acousto-optik modülatör (MQ110-A3-UV, silika-AA-Opto-elektronik erimiş 355 nm) örnek teslim UV lazer gücünü kontrol.
Mikroskop objective.The aşamasında bir 3 eksenli doğrusal DC motor mikro konumlandırma oluşan daldırma bir 60X, 0.9 NA su ile donatılmış - holografik optik cımbız ve lazer mikro-disektör değiştirilmiş bir dik mikroskop (Olympus BX51) ile entegre edildi en alt nanometre çözünürlükte numunenin kaba hareketi birleştirmek için ayrı bir 3 eksenli piezoelektrik nano-konumlandırma aşaması (P-733.3DD, Fizik-Araçlar) taşıma sistemi (M-126.CG1, Fizik-Araçlar) piezo- sahne. Mikroskop sahne sistemi iki kontrol ile donatılmış sinerjik Seçilen çalışma modu (statik veya dinamik pozisyon ya da güç kelepçe,) 16 bağlı olarak sağ tarafta yakalama odak nokta korumak için hareket döngüler. Özellikle, bir iç geribesleme döngüsü, seçilen bir de boncuk tutmak için, bir piezoelektrik sahne üzerinde hareket edertuzak merkezine ed mesafe. Diğer dış döngü elinde bulunan inme 17 daha geniş bir alan üzerinde piezo-aktüatör tarafından yayılmış bölge yararlanmak için motorlu sahne konumunu kontrol eder. Bu örnek yapıştırılır tuzak boncuk izleme için bir piezo-aşamalı bir yönde mevcut inme sınırına ulaştığında, dış döngü ters yönde mikro düzeyde taşır, ve böylece bir piezo merkezi konuma doğru kurtarır. Piezo aşamalı onun ders aralığının merkezi konumuna ulaştığında, mikro düzeyde durdurdu. Sistemin diğer detayları Guiggiani ark 16,17 bildirilmiştir.
Bir Peltier cihazı (TC-344B çift kanal ısıtıcı kumanda ile QE1 rezistif ısıtma - Warner Instruments) mikroskop (37 ° C) altında hücre kültürünün sıcaklığını kontrol eder. Kültüründe, pH ve nem özel tasarlanmış bir polidimetil havalandırarak fizyolojik şartlar altında muhafazanemlendirilmiş carbogen (% 95 O 2,% 5 CO 2) ile siloksan (PDMS) kol (mikroskop objektif entegre).
2. Hücre Kültürü hazırlanması
Tüm deneysel protokolleri İtalyan Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanmıştır. Birincil kültürleri embriyonik gün 18 (E18) olarak farelerin hipokampi (C57BL6J, Charles River), elde edildi.
- Nöronlar cam alt Petri kapları ile 25.000 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda (- matek Şirketi P35G-0-14-C) kaplandı. Kültür hücrelerinin düşük konsantrasyonda daha önce in vitro ilk günlerinde yoğun bir ağ oluşumunu önlemek için gereklidir. Bahsedilen hücre konsantrasyonunda, diğer hücrelere bağlı olmayan bir uzun nörit ile izole hücreler bulunma ihtimali daha yüksektir.
3. Boncuk Kaplama
- Polimer mikroküreler (Ø 4 mikron, COOH-sona-Bangs Laboratuvarları, ürün kodu PC05N/6700) poli ile kaplanmıştırPolyLink protein bağlantı kiti (Polysciences, ürün kodu 19539) 'de tarif edilen prosedür takip-D-lizin. • Boncuklar kültür desteği ve iyilik hücre yapışma kapak için kullanılan aynı molekül ile kaplanmıştır.
4. İzole Nöron seçin. Kültür Yüzey, Trap A Boncuk ayırmak ve Nöron yanında bu taşı
- Mikroskop sahnede kültür Petri kabı koyun. Sahne hareketi ile örnek odak ayarladıktan sonra, Kohler-aydınlatma ayarlamak için aydınlatıcı amacı kondansatör olarak görev düzeltin. Kolher-aydınlatma koşulu ayarlamak için aydınlatma optik hizalama parlak bir alan görüntü kalitesini artırmak için gereklidir. Hizalama koşullar kullanılarak, bu QPD ve PD tarafından interferometrik izleme gerçekleştirmek için, saçılma tuzak prob, aynı zamanda kızılötesi lazer toplama verimi (objektif Kondansatörden) en üst düzeye çıkarmak için gereklidir.
- , Kaplanmış mikro stok solüsyonu birkaç ul pipetkültür çanak. Mikroküreler yatırmak ve kültür yüzey uyacaktır. Kültür kabına enjekte ul sayısı stok solüsyonu mikro konsantrasyonuna bağlıdır. İdeal durumu görüş görüntüleme alanında başına mikroküreler bir ila iki sahip olmaktır. Çok fazla mikro kültür çanak eklendiğinde, zaten kültürlü nöronlar için rastgele ekleyebilirsiniz.
- Uzun nörit (akson) ile izole bir nöron ararken, kültür çanak içinde hareket ve mikroskop sahne yerini kaydedin.
- Hareket ve kültür destek yapıştırılmış bir boncuk aramak.
- IR yakalama Lazer açın. Bu aşamada, hiçbir hologramlar SLM yansıtılır ve IR lazer nokta konumunu UV lazer nokta konumu ile çakışmaktadır. Mikroskop sahne hareketi ile 2-3 mikron kültür destek yüzeyi üzerinde IR nokta, eksenel konumunu ayarlayın.
- En az 1 μW için örnek teslim UV lazer gücü.UV lazer disektör daha önce 14 kalibre edilmiştir:
5-6 μW cam desteği ablasyon edilir
4 μW bir nöronal bağlantı tamamen disseke edilir
Bir nörit kısmen lezyonlanmıştır olduğu 2.5 μW
<1 μW bir şok dalgası kültür tabağına üretilir. Optik şok dalgası cam desteğinden boncuk ayırmak için yeterince güçlü. - Üzerindeki IR lazer bırakarak, UV lazer açın ve mikroskop sahne hareketi ile yapıştırılır boncuk üzerinde UV nokta hareket ettirin. Boncuk yüzeyden ayrılır ve bu kızılötesi lazer tarafından tutulur. Daha sonra, UV lazer kapatın.
- Cam desteği (20-30 mikron) Yukarıdaki tuzak boncuk birkaç mikrometre taşıyın. Bu konuma boncuk Kaldırma o daha önce seçilen nöron doğru hareket edilirken diğer hücrelere temas önlemek olacaktır. Önceden kaydedilmiş sahne konumuna boncuk getirin. Sürükle sıvı güç optik tuzak aşmayacak kadar düşük bir değer (10 mm / sn) için sahne hızını ayarlamaping güç.
5. Bilgisayar oluşturuldu Hologram tarafından Lazer Disektör Nokta ve Axon pozisyonu Göre tuzak pozisyonu taşıyın ve Optik Cımbız Sertlik kalibre
- Akson görselleştirmek için cam destek doğru boncuk taşıyın. Boncuk bu (yaklaşık 5 mikron cam desteği yukarıda) ile temas önlemek için hücre üzerinde tutulur.
- Akson genişliği ortasına UV odak nokta taşımak için mikroskop sahne hareket ettirin. Gelinen aşamada konumunu kaydedin.
- Bilgisayar tarafından oluşturulan hologram ile IR odak nokta konumuna getiriniz. Bu adımda, aşama, önceki adımda seçilen bir konumda durdurulur. Bilgisayar oluşturulan hologram SLM yansıtılan zaman, tuzak boncuk akson göre taşınır. Biz de aynı akson merkezli UV lazer nokta ile, tuzak boncuk neurite ortasına uyumlu olması için IR lazer nokta taşıyın. IR spot ve böylece tuzak boncuk neurite boyunca konumlandırılmışUzak UV nokta 5-10 mikron. Biz neurite geometrisine bağlı olarak UV nokta ile ilgili olarak IR hareket ettirmek. Optik cımbız bir SLM sistemi ile donatılmıştır getirilmemesi durumunda, konumunu IR optik yolda eğerek aynalar veya akustik optik külahı, tarafından değiştirilebilir. IR lazer nokta onun Brown hareketi etkileyen ve kuvvet spektroskopisi izleri değiştirebilir tuzak prob ile diseksiyon ışının optik etkileşimi önlemek için UV nokta uzak 5-10 mikron yerleştirilmiş olabilir.
- UV spot ve akson pozisyonu ile ilgili yeni IR nokta pozisyonu tanımladıktan sonra, uzak akson gelen tuzak boncuk yerleştirin ve onunla çarpışmayı önlemek için sahne hareket ettirin. Cam kapak üzerinde yaklaşık 2 mikron için tuzak boncuk eksenel konumuna getiriniz.
- Merkezi üzerinde girişim saçaklar için QPD hizalayın: QPD merkezli zaman x ve y QPD diferansiyel sinyalleri sıfırdır. Interfero tarafından tuzağa boncuk Brown hareketi 5 sn Edinmemetre, 50 KHz örnekleme hızında. Güç spektrumu yöntemi 18 ile optik tuzak sertliği (pN / nm) ve duyarlılık (V / nm) edinin.
6. Axon için Boncuk takın. Axotomy ve Eşzamanlı Kuvvet Ölçüm yapın
- Cam kapak üzerinde 4 mikron yaklaşık tuzak boncuk konumunu yükseltmek ve (adım 3.2) önceden kaydedilmiş sahne konuma taşıyın.
- Akson doğru tuzağa boncuk aşağı hareket ettirin temas neurite kadar. Tuzak boncuk ve akson arasındaki çarpışma eksenel yönde sıkışıp boncuk yerinden tespit z QPD sinyal tarafından izlenir.
- Tuzak boncuk ile 10 saniye bekleyin neurite membran olan yapışma lehine akson karşı itti.
- Akson gelen tuzağa boncuk yerinden için mikro düzeyde hareket, ve böylece hücre zarı kendi yapışma doğrulayın. Boncuk yapıştırılır, bu optik tuzak kaçar.
- Yapıştırılır boncuk üzerinde lazer tuzak geri hareketve sıfıra eşit güç koşulu ile kuvvet-kelepçe döngü açın. Böyle bir şekilde, optik tuzak merkezi, hücreye bağlı bir piezo-aşamalı konumlandırır boncuk,. Sistemin bir geri besleme döngüsü kontrolü yoksa, lazer tuzak konumu yapıştırılır probu üzerinde merkezi ona mikroskop sahne hareket ettirilebilir. QPD sinyalleri boncuk tuzak ve hücre (x ve sıfıra eşit y QPD sinyalleri, ve z QPD sinyal dört bölümün aynı gerilim toplamı verir yapıştırılır değilken aynıdır zaman tuzak merkezi ulaşıldığında gibi boncuk) herhangi bir yüzeyinden uzakta tutulur iken.
- Yapıştırılır tuzak prob bir gösteriş oluşturmak için, boncuk merkezi (yaklaşık 100 nm) biraz üzerinde yakalama lazer konumlandırma z ekseninde bir güç-kelepçe durumu, ayarlayın. Sistem bir kuvvet-kelepçe kontrolü ile donatılmış değil durumda, optik tuzak konumu mikroskop sahne tarafından 25 nm adım kadar yükseltilebilir. Z QPD sinyal izleme sağlar. Bu nedenle, thi kullanıns yapıştırılır prob ile ilgili olarak lazer tuzak konumunu ayarlamak için sinyal. Bu tür ön-gerilim aksonal lezyon sonra membran üzerindeki yükü ve yapıştırılır prob Brown hareketi azalmayla algılamak için gereklidir. Benzer bir yaklaşım Video görüntüleme 19 tarafından bir zar ip gerginlik serbest bırakılması ölçüm için önerilmiştir.
- Kapatma pozisyon kelepçe durumu (piezo kademeli engellenir) olarak yapıştırılır prob üzerindeki kuvvetini ölçmek için kuvvet-kelepçe geribildirim.
- Lazer axotomy zaman atlamalı parlak alan görüntüleme (20 Hz kare hızı) sırasında interferometre (20 KHz örnekleme frekansı) ve hücre aracılığıyla tuzak prob pozisyonların eş zamanlı kayıt başlayın.
- Bir lezyon akson imajını (. Genellikle 200-400 optik darbe darbe başına enerji ihtiyaç vardır: 25 NJ) görünür hale gelinceye kadar lazer darbeleri sunmak için UV lazer açın, daha sonra UV lazer kapatın.
- Yaklaşık 3 mi için interferometre tarafından kayda devamn, x, y ve z QPD izleri bir plato ulaşana kadar.
7. Toplam Gerilim Release sayısal
- Nanometre, ilgili izleri elde etmek için, optik tuzak kalibre hassasiyeti tarafından kaydedilen QPD izleri (Volt) dönüştürün.
- 10 Hz kesilmiş bir yüksek geçiren filtre tarafından x, y, ve z yer değiştirme izleri Filtre.
- Tuzak boncuk Brownian hareketi, süzüldü izlerin varyansın hesaplayın. 500 msn (10.000 veri noktası) 20 kez üst üste binen pencereleri için 25 msn adımları varyans hesaplayın. Izlerinin filtreleme yüksek geçiren zar dalgalanması veya kortikal aktin hareketi nedeniyle Brown hareketi değişiklikler hariç tutmaktadır. Kordonun Brown hareketi, hücre zarı üzerinde optik güçleri ve yapışma güçleri tarafından azaltılır. Membran nedeniyle viskozitesi artar gerilim serbest bırakılması ve böylece boncuk Brown hareketi gergin edildiğinde, hemen tespitrilmesi axotomy sonra, azalmaya başlar.
- T0 tanımlayın: Brown hareketi varyans azalma başında, UV lazer enerjisinin doğumdan sonra. Zaman anlık t0 membran gerginlik başında gösterir.
- Brown hareketi varyans (bir plato ulaştığında) azalma sonu: t1 tanımlayın. Zaman anlık t1 membran gerginlik sonunda gösterir.
- Kuvvet ölçüm sırasında numunenin herhangi bir sürüklenme ölçmek için, cam kapak destek enkaz veya bir çizik video izleme yapın. Cam destek parçacık izlemek için, öncelikle siyah bir arka plan üzerinde beyaz parçacık ile ikili görüntülerin bir yığın elde etmek için, parlak alan görüntülere eşikleri geçerlidir. Daha sonra, alt-piksel doğruluk (ücretsiz ImageJ yazılımı kullanarak) ile kütle parçacık merkezi izleyebilirsiniz.
- Yer değiştirme QPD izlerinden ölçülen sürüklenme çıkarın. Ilgili kalibre optik sertlik (k x, k sürüklenme-düzeltilmiş QPD izleri çarpın
- Olarak toplam kuvvet iz hesaplayın F tot = √ (Fx 2 + Fy 2 + Fz 2).
- Olarak t0 ve t1 arasında yürürlükte toplam serbest hesaplayın F serbest = F tot (t1) - F tot (t0). Bu tuzak merkezi sonda yer değiştirmesinden dolayı, çünkü t0 ölçülen kuvvet çıkarılmak üzere olduğunda nörit için boncuk yapışır.
- Tuzak boncuk ve UV lazer nokta konumu arasındaki neurite temas alanı hesaplayın: tuzak boncuk ve UV lazer nokta konumu arasındaki neurite en parlak bir alan görüntü önlem uzun (L) ve kısa (D) eksen. Akson temas alanı A akson olan = L x D.
- Tarafından yayımlanan toplam serbest F kuvveti Normale akson temas alanı bir akson.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücre onun odak yapışıklıklar yüzeye çekiş kuvvetleri oluşturur. Sitoskeletal elemanlar tarafından üretilen kuvvet, kültür substrat olarak, karşı kuvveti ile denge içinde bulunmaktadır. Nevrit lazer kaynaklı lezyon sonra, hücre iskeletinin gerildi bazı kabloların bozulur ve katmanların yapışması karşıt kuvveti ortadan kalkar, çünkü onların dengelenmiş gerilim serbest bırakılır. Serbest gerginlik kısmen etkilenmeyen odak yapışıklıklar dağıtılan ve bir optik tuzak düzenlenen hücre zarı, bağlı boncuk, (şematik bkz. Şekil 1) yüzeye hücre ankraj iskelet elemanları ortadan kaldırmamaktadır bu sürümü kısmını ölçer .
, Şekil 2, yukarıda tarif edilen deneysel protokole temsili bir sonuç olarak, rapor etmektedir. Nöron, Şekil 2a sol panelinde, ayırt n akson tanımlayan bir uzun nörit, sunarEURON. Şekil 2a Sağ panelde, aynı nöron bağlı aksonal lezyon (beyaz ok ile gösterilen) sonra gösterilmiştir. Şekil 2b x, y, ve z yönlerinde kaydedilen boncuk deplasman izlerini gösterir. Şekil 2c bir çizik ve video izleme raporlar cam destek, dikkate almak ve ölçüm sırasında sahne sürüklenme ortadan kaldırır.
Şekil 3a, sol panelde, biz lezyonlu neurite ve biz gerilim serbest ölçüm sırasında neurite çapının kymograph hesaplamak beyaz çizgi yukarı lezyon yerinde, göstermektedir. Sağ panelinde kymograph neurite çapı biraz hemen lezyon sonra artar ve daha sonra hücre soma doğru gerilim serbest bırakılması nedeniyle incelir gösteren vardır. Şekil 3b, biz kymograph sonucu miktarı belirlenir. Biz Atta konumlandırılmış yana nörit arka plan ile ilgili parlak görünürobjektif odağı merkezinde boncuk dür ve bu nedenle akson odak biraz dışında. Gerçekten de, zaman atlamalı video kayıt her karede kymograph hattı boyunca piksel yoğunlukları toplamı bildirerek, tansiyon serbest bırakılması sırasında neurite çapında bir tahmin edinin. Paneli 3c, biz gerginlik yayın sırasında ekli boncuk toplam varyansın rapor, yüksek geçiren 10 Hz kesme frekansta filtreleme sonra interferometre (Şekil 2b) tarafından kaydedilen izleri göre hesaplanır. Biz varyans lezyon sitenin yukarı malzeme birikimi sırasında akson çapı artar gözlemleyebilirsiniz. Daha sonra, varyans membran gergin olduğunda (Şekil 3c t0) azalmaya başlar, ve neurite çapı çok azalır. Varyans düşüş gerilim serbest durur bir plato (Şekil 3c t1), ulaşır. T1 sonra, Brown hareketi artmaya başlar, çünküekzositoz 21 (Şekil 3c bakınız) muhtemelen nedeniyle membran gevşeme.
Şekil 4a olarak, beyaz kutu akson temas alanı kültür desteği ile bir akson tahmini gösterir. Bir akson UV lazer nokta konumu ve tuzak prob merkezi arasında hesaplanır. Şekil kalibre ilgili tarafından sürüklenme-düzeltilmiş QPD yer değiştirme izleri (Şekil 2b) çarpılması sonra elde edilen toplam serbest F kuvveti genliği iz serbest 4b raporları optik tuzak sertliği (k x, k y, k z). Zaman t1 ve t0 (Şekil 4b de ΔpN) ölçülen gücü arasındaki farkı hesaplamak ve sonra pN / mikron 2 açısından yayımlanan gerilim elde etmek için, bir akson bölün.
Örnek farklı nöronlar üzerinde aynı protokol tekrarlayarak başlayabilirçeşitli kültürler üzerinde deneyler seans kimyasal faktörler ile muamele edilmiş ya da farklı destekler üzerine kaplandı ve son olarak da ayrı deney koşullarında elde edilen ortalama değeri karşılaştırır. Şekil 5'te, aksonal lezyon sonra gerilim serbest bırakılması yüzeye odak yapışıklıklar nemlendirilmiş olduğunu göstermek, böylece daha yüksek bir gerilim bırakma değeri bir akson az yüzeye yapıştırılır anlamına gelir. Bir kısmi ve tam değil, akson lezyon neden için, biz teslim toplam enerji ölçülen gerilim sürümü bağımlılığı araştırıldı ve lezyon site ve tuzağa boncuk arasındaki neurite temas alanı üzerinde. Biz ışık darbeleri daha yüksek bir dizi sunarak daha fazla iskelet elemanları yok ve dolayısıyla gerilim daha yüksek bir sürümü ikna etmek için çalıştı. Aksi takdirde, artan nörit temas alanı, tansiyon sürüm daha düşük bir miktarını ölçmek bekleniyor. Şekil 5'te, yukarıda değinilen iki parametrelere bağımlı olduğunu göstermektediraçık değildir. , Aynı mikroskop objektif ve aynı enerji kullanırken değişmez ablasyon nokta 8, en boyutu ile ilgilidir, bu nedenle, biz bağlı kısmi lezyon (protokol adım 4.5 'e bakınız darbe başına daha önce kalibre düşük enerji ile) çıkarılabilir örnek de başına darbe. Iyi gibi parametreler yüzeye hücre yapışması iyi bir tahmin temsil etmemektedir bilinmektedir çünkü odak yapışıklıklar sadece% 1 işgal Dahası, gerilim serbest bırakılması temas alanına korelasyon olması, şaşırtıcı değildir bazal yüzey 22.
1 Şekil. Lazer axotomy sırasında kesintiye hücre iskeleti denge grafiksel gösterimi. Bir hücre fokal yapışıklıklar bir yüzeye yapışır. Mavi oklar siskelet elemanları (yaylar ile gösterilir) tarafından oluşturulan çekme kuvvetlerinin ip ariş ederken. Işık mavi oklar katı kültür yüzey tarafından oluşturulan karşı güçler göstermektedir. Basitleştirilmiş bir senaryoda, lezyon önce, iskelet ve yüzey kuvvetleri eşleştirilmiş ve dengelenir. Nevrit, lazer kaynaklı lezyon sonra, bazı yaylar ve tabaka arasındaki bağlantı bozulur. Bu nedenle, alt tabakanın cytoskletal elemanın çekme gücü ile mücadele artık mevcut değildir. Tuzak boncuk, membrana bağlı, serbest hücre iskeletinin kuvvetlerin yön izler.
Şekil 2. Bir, boncuk tuzak lazer kaynaklı lezyon sırasında hipokampal nöronun akson zarı bağlı. (A) Parlak alanın İnterferometrik izleme görüntü bir akson ablasyon sırasında satın aldı. Sol paneldeki lezyon önce. Sağ paneldeki lezyon sonra. Bir poli-D-lizin kaplı boncuk zar (polistiren boncuk, 4 mikron o) bağlanır ve bir optik tuzak içinde tutulur. Örnek de IR lazer ortalama gücü 14 mW. Beyaz ok lezyon yerinde gösterir. Bar 5 mikron. Optik tuzak boncuk pozisyonunun arka odak düzlemi interferometri (b) Recorded izleri. Mavi, yeşil ve kırmızı izleri sırasıyla x, y, ve z eksenleri boyunca boncuk konumunu temsil eder. Örnekleme oranı 20 kHz. (C) Video izleme ile ölçülen kültür destek bir çizik Deplasman sahne sürüklenme izlemek için. Mavi ve yeşil izleri görüntü izleme ile elde edilen x ve y pozisyonu vardır. Kare hızı 5.5 Hz.
77fig3.jpg "/>
Şekil 3,. Gerilim yayın sırasında akson çapı ve lezyon akson membran genleşme analizi. Sol panelinde lezyonlu akson (a) Aydınlık alan görüntüsü,. Akson için beyaz çizgi dik bir kymograph hesaplanır konumunu gösterir. Yukarı lezyon sitenin akson çapının sağ panelinde, kymograph,. Kymograph her satır 0.18 sn karşılık gelir. (B) gerilim yayın sırasında akson çapının tahmini temsil eden kymograph her satırın piksel yoğunlukları toplamı. (C) boncuk Brown hareketi toplam varyans bağlı akson (t0 ve t1 sırasıyla diseksiyon sonra akson başlangıcında ve gerilim serbest sonuna gösterir).
0477/50477fig4.jpg "/>
Şekil 4. Axotomy sonra serbest gerginlik ölçümü. Lezyonlu akson (a) Aydınlık alan görüntüsü. Beyaz kutu lezyon yerinde ve tuzak boncuk merkezi arasındaki neurite temas alanının tahmini gösterir. (B) axotomy (F tot = √ (Fx 2 + Fy 2 + Fz sonra ölçülen kuvvet toplam genlik İz 2)). Fx, Fy ve Fz yer değiştirme izleri Şekil 2b gösterilen olanlar Hooke yasası (F = kx), hesaplandı. Optik tuzak üç ortogonal yönde katılıkları, güç spektrumu yöntemi (K x, y = 7.9 pM / um, k z = 2.3 pM / um) kullanılarak hesaplandı. ΔpN zaman instants t0 ve t1 arasında ölçülen serbest gücü gösterir.
Şekil 5,. Örnek teslim enerji miktarına ölçülen gerilim serbest Bağımlılığı ve neurite temas alanı üzerinde. 3 SAYI de fare hippocamapal nöronların akson yapılan 26 deney verileri. Nörit temas karşı gerilim serbest (a) Dağılım arsa lezyon ve tuzak boncuk bölgeler arasında. gerilim serbest karşı örnek neurite temas teslim enerji miktarı (b) Dağılım arsa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz bu çalışmada lazer kaynaklı hücre lezyon sırasında aynı anda kuvvet spektroskopisi ölçüm yaparak, kültür yüzeye neurite yapışma karşılaştırmak için kantitatif bir yöntem rapor. Gerilim Ölçülen serbest yüzeye hücrenin yapışma derecesi ile ilgilidir: odak yapışıklıklar daha yüksek bir sayı ile hücrelerin daha az gerilim serbest olmalıdır. Piconewtons açısından gerilim salınımını Ölçüm farklı deneysel koşullar 14 kültür destek aksonal yapışma değerlendirmek için hangi fiziksel bir miktar sağlar.
Çeşitli laboratuarlar farklı optik tasarımlar 23 benimseyerek, bir optik cımbız sistemi ile lazer disektör entegre. Bizim seçim sabit optik yol ve mikroskop sahne hareketi ile bir kurulum oldu. Bunu gerçekleştirmek için, UV lazer konumuna göre yakalama noktaya taşımak için kızılötesi lazer ışını yolunda bir mekansal ışık modülatör tanıtmak. Rağmen galvanometric aynalar örnek hareket ettirmeden lazer odak konumunu direksiyon izin, onlar kuvvet spektroskopisi ölçümleri etkileyen sisteminde mekanik paraziti üretebilir. Brown hareketi analizi optik sertlik hızlı bir yeniden kalibrasyon izin Dahası, biz, örnek yeniden konumlandırmak IR lazer odak karar verdi. Örnek üzerine UV lazer nokta pozisyonu Hareketli sadece merkezi konumundan kirişin küçük yer değiştirmeler için önemsiz olan UV odak nokta kendisi kalitesini etkileyen küresel sapmaları üretebilir. Bu nedenle, lazer disektör, optik özelliklerinin değişiklik varlık zarar karşı teslim lazer güç bir de novo kalibrasyon gerektirebilir.
Kuvvet spektroskopisi ölçümü ile, biz gerilim sürümü birkaç saniye hızlı bir faz ve saniye bazı onlarca sürebileceğini yavaş faz oluştuğunu gözlemlemek olabilir. Bazen daha önceki çalışmaları 14, yavaş raporfaz birkaç dakika son verebilir. Bu nedenle, biz kültür destek bir çizik izleme Video tarafından kuvvet ölçüm düzeltmek zorunda kaldı. Gelecekte, daha iyi bir yaklaşım cam kapak bağlı bir boncuk video veya İnterferometrik izleme tarafından mikroskop sahne konumunu otomatik düzelten bir geri besleme döngüsü, ile sahne sürüklenme iptal olacaktır. Yapılandırma Bu tür, zaten literatürde bildirilen, ekli boncuk merkezli ikinci bir lazer ışını gerektirir, ve alt-nanometre hassas 24,25 ile sahne istikrar sağlar.
Gelecekte, farklılaşma farklı aşamalarında kültür destek için aksonal yapışma karşılaştırmak ve farklı patolojik durumlarda farmakolojik tedavi için bir kantitatif sağlamak için geliştirilen protokol uygulamak istediğiniz. Ayrıca, aynı protokol farklı mekanik ile malzemelerin farklı türde nöronal yapışma karşılaştırmak için, implante edilebilir iskelelerinin tasarımı için geçerli olabiliranical veya kimyasal özellikleri 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Gerçek zamanlı kontrol sistemi, anlayışlı tartışmalar, Giacomo Pruzzo ve Alessandro Parodi özel elektronik ve yazılım geliştirme için, ve Claudia Chiabrera ve uzman tavsiyesi ve hücre kültürü hazırlanmasında yardım için Marina Nanni için Evelina Chieregatti ve Hanako Tsushima geliştirmek için Alberto Guiggiani.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | Hamamatsu | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop | ||
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
- Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
- Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).
- Stiess, M., Maghelli, N., et al. Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation. Science. 327, 704-707 (2010).
- Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap. Cytometry. 12, 505-510 (1991).
- Pinato, G., Raffaelli, T., D'Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells. J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).
- Kress, H., Park, J. G., et al. Cell stimulation with optically manipulated microsources. Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).
- Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
- Difato, F., Dal, M. M., et al. Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks. Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- O'Toole, M., Miller, K. E. The role of stretching in slow axonal transport. Biophys. J. 100, 351-360 (2011).
- O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).
- Difato, F., Tsushima, H., et al. The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF. Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).
- Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks. International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).
- Guiggiani, A., Torre, B., et al. Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers. Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).
- Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. 3rd Real Time Linux Workshop. , (2011).
- Neuman, K. C., Block, S. M.
- Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair. Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).
- Kress, H., Stelzer, E. H., et al. Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).
- Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope. Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).
- Carter, A. R., King, G. M., et al. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review. Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).
