Summary
Wir messen die Spannung zu lösen in einem Axon, die teilweise mit einem Laser dissector durch gleichzeitige Kraft-Spektroskopie-Messung an einem optisch gefangen Sonde haftete an der Membran des Axons durchgeführt wurde lädierten. Das entwickelte Versuchsprotokoll wertet das Axon Haftung auf dem Kultursubstrat.
Abstract
Die Bildung von funktionalen Zusammenhänge in einem Entwicklungsland neuronale Netzwerk wird durch extrinsische Cues beeinflusst. Das Neuritenwachstum von sich entwickelnden Neuronen unterliegt chemische und mechanische Signale, und die Mechanismen, durch die er spürt und reagiert auf mechanische Signale werden kaum verstanden. Die Aufklärung der Rolle der Streitkräfte in Zell-Reifung wird das Design von Gerüsten, die Zelladhäsion und Zytoskelett-Kopplung mit dem Substrat zu fördern und damit die Verbesserung der Fähigkeit der verschiedenen neuronalen Typen nach einer Verletzung regenerieren.
Hier beschreiben wir eine Methode, um die gleichzeitige Kraft-Spektroskopie-Messungen während der Laser-induzierten Zell-Läsion gelten. Wir messen Spannung Release in der teilweise lädierten Axon durch gleichzeitige interferometrischen Tracking eines optisch gefangen Sonde haftete an der Membran des Axons. Unsere experimentellen Protokoll erkennt die Spannung Release mit Pikonewton Empfindlichkeit und die Dynamik der Spannung Freisetzung beiMillisekunden-Auflösung. Somit ist es ein hochauflösendes Verfahren zu untersuchen, wie die mechanischen Verbindungen zwischen den Zellen und Substrate moduliert werden kann durch medikamentöse Behandlung und / oder durch unterschiedliche mechanische Eigenschaften des Substrats.
Introduction
Optische Mikroskopie ist eine der weniger invasiven bildgebenden System zur Verfügung zu lebenden Zellen zu beobachten. Mit der Nutzung von Effekten wie Strahlungsdruck (wie in einer optischen Pinzette 1) oder hochenergetischen Photonen-Flux (wie im Laser dissector 2) wurde diese Technologie, um Nano-Manipulation erweitert. Die optische Imaging-System liefert eine präzise Steuerung zu visualisieren und zu manipulieren sub zellulären Targets 3. Zur gleichen Zeit, dank der präzisen Kalibrierung des gelieferten Laserleistung, erreichen optischen Werkzeuge entweder weich oder invasive Probenmanipulation mit beispielloser Reproduzierbarkeit.
Mehrere Labors integriert, in derselben Versuchsanordnung, optische Pinzetten und Laser Dissektor um Organellen 4, miteinander zu verschmelzen verschiedenen Zellen 5 oder Zellen durch optisch angetrieben Ladungen 6,7 stimulieren abzutragen. Während optische Pinzette, nach der Kalibrierung des optischen Steifigkeit, für erlaubendie Kontrolle der aufgebrachten Kraft auf die Zelle auf einer Skala Pikonewton können Laser Dissektion Systeme modulieren optische Manipulation, die von Membran Foto-ration der Ablation einzelner Organellen oder Dissektion der sub-zellulären Strukturen reicht. Jedoch beruht Laser Dissektion Kalibrierung auf qualitative Beurteilung der Einheit von optischen Manipulation in Bezug auf die Energie, die an die Probe, vor allem auf Bildanalyse veranschaulicht morphologischen Veränderungen verursacht, die dem Muster 8 basiert. In dem vorgestellten Verfahren zeigen wir, wie man Kraft-Spektroskopie Messung während des Laser axonal Dissektion einer sich entwickelnden Neuronen führen, zu quantifizieren, auf Pikonewton Skala, die Kraft durch eine veränderte Gleichgewicht im Zytoskelett-Struktur eines sub-zellulären Fach 9 produziert. Kultivierten Neuronen an dem Substrat haften, und während der Entwicklung zu polarisieren. Die Polarisation Phase tritt während der ersten fünf Tage in vitro. In Stufe zwei der Polarisierung, einer der Extrudering Neuriten länger wird, und es wird zu differenzieren, um das Axon 10 geworden. Axonal Dehnung in Reaktion auf Zugkraft am Wachstum Kegel wurde zuvor von Dennerl-Modell 11 modelliert. Vor kurzem ist dieses Modell 12 verlängert, um die Rolle von Neuriten Adhäsion an die extrazelluläre Matrix Substrate umfassen. Diese biophysikalische Modell nach experimentellen Beobachtungen 13 vorgeschlagen, zeigten, dass Zugkräfte auf das Wachstum Kegel, der sich entlang der Neuriten, moduliert von fokalen Adhäsionen zu dem Substrat. Ebenso produziert axonale Läsion eine lokale Freisetzung von Spannungen hin ausbreiten Zellkörper. So haben wir vorgeschlagen, dass die Messung solcher freigegeben Spannung an einem Ort entlang des Axons zwischen der Verletzung und der Zelle soma bietet die Möglichkeit, die dämpfende Ergebnis unberührt fokalen Adhäsionen zu bewerten.
Wir kalibrieren die notwendige Energie Photon-Fluss des Lasers Dissektor, um das Ausmaß des zugefügten axonalen damag steuerne, von der kompletten Durchtrennung einer partiellen Läsion. Nach der Kalibrierung, wiederholten wir partielle Läsion der Axone von mehreren differenzierenden Neuronen und entwickelte das Protokoll, um die Spannung zu lösen quantifizieren und somit erhalten eine quantitative Parameter, um die Haftung der Axon auf das Substrat 14 zu schätzen.
In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir im Detail die entwickelte Protokoll, das eine genaue experimentelle Verfahren zu ermitteln und zu vergleichen mit Pikonewton Empfindlichkeit des axonalen Haftung auf dem Substrat in verschiedenen experimentellen Bedingungen wie chemische Behandlung 14, oder verschiedene Arten von Zellkultur Unterstützung darstellt.
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Protocol
1. Optischer Aufbau
Das gesamte optische System wurde zuvor 15 beschrieben. Kurz gesagt, wird die optische Pinzette-System auf einer Ytterbium Dauerstrich (CW)-Faser-Laser, der bei 1064 nm (IPG Laser GmbH) basiert. Räumlicher Lichtmodulator (SLM) (LCOS SLM, Modell X10468-07 - Hamamatsu) variiert die Phase des ankommenden IR Laserstrahl, um die Position der Trapping Brennfleck auf der Kulturschale von computergenerierten Hologrammen steuern. Die frei verfügbaren Blue-Pinzette-Software (Web-Link auf Geräte-Tisch) Hologramme auf der Licht-Raum-Modulator projiziert. Und einer Photodiode (PD, PDA100A-EC - Thorlabs) - Das Interferometer für Kraft-Spektroskopie-Messungen wurde auf einem Vier-Quadranten-Photodiode (Hamamatsu QPD, S5980 mit C5460SPL 6041 board) basiert.
Der Laser Dissektion Quelle war eine gepulste Subnanosekundenbereich UV Nd: YAG-Laser bei 355 nm (PNV-001525-040, POWERCHIP nano-Pulse UV-Laser - Teem Photonics). Ein akusto-Modulator (MQ110-A3-UV, 355 nm Quarzglas-AA-Optoelektronische) gesteuert die Leistung des UV-Lasers in die Probe ein.
Mit einem 60X, 0,9 NA Eintauchen in Wasser objective.The des Mikroskops von einem 3-Achsen linear Gleichstrommotor Feineinstellplatten besteht ausgestattet - das holographische optische Pinzette und Laser-Mikro-Dissektor wurden auf einer modifizierten aufrechtes Mikroskop (Olympus BX51) integriert System (M-126.CG1, Physik-Instrumente), die eine separate 3-Achsen piezoelektrischen Nano-Positionierung der Bühne (P-733.3DD, Physik-Instrumente), um grobe Bewegung der Probe mit dem Sub-Nanometer-Auflösung des Mähdreschers piezo- Stufe. Das Mikroskop Stufen-System mit zwei Schlaufen ausgestattet synergistisch wirkt, um das Einfangen Brennfleck an der richtigen Stelle zu halten, je nach der gewählten Arbeitsmodus (Position oder Kraftklemme, statisch oder dynamisch) 16. Insbesondere wirkt eine interne Rückkopplungsschleife auf einem piezoelektrischen Bühne, um den Wulst an einer select haltened Abstand aus der Falle entfernt. Die anderen externen Schleife steuert die Position des motorisierten Bühne, um die Region mit den Piezo-Aktor auf eine größere Fläche als die zur Verfügung stehende Hub 17 überspannt auszunutzen. Wenn das Piezo-Stufe die Grenze der zur Verfügung stehenden Hub in einer Richtung erreicht, die äußere Schleife die Mikro Stufe in entgegengesetzter Richtung, wodurch der piezoelektrische wieder in seine zentrale Position, weil es Tracking wird die eingeschlossene Wulst geklebt auf die Probe. Wenn der Piezo-Bühne die zentrale Position seines Kurses Bereich erreicht, stoppte der Mikro Bühne. Weitere Einzelheiten der Anlage sind in Guiggiani et al 16,17 gemeldet.
Ein Peltier-Vorrichtung (QE1 Widerstandsheizelement mit TC-344B Zweikanal Heizungssteuerung - Warner Instruments) regelt die Temperatur der Zellkultur unter dem Mikroskop (37 ° C). In der Kultur, pH und Feuchte unter physiologischen Bedingungen durch Belüften eine speziell angefertigte Polydimethyl beibehaltenSiloxan (PDMS) Hülse (Integration des Mikroskop-Objektivs) mit angefeuchteten Carbogen (95% O 2, 5% CO 2).
2. Cell Culture Vorbereitung
Alle experimentellen Protokolle wurden vom italienischen Ministerium für Gesundheit genehmigt. Primäre Kulturen wurden aus hippocampi von Mäusen (C57BL6J, Charles River) an embryonalen Tag 18 (E18) erhalten.
- Neuronen wurden bei einer Konzentration von 25.000 Zellen / ml auf Glasboden-Petrischalen (- MATEK Gesellschaft P35G-0-14-C) beschichtet. Die niedrige Konzentration der kultivierten Zellen benötigt wird, um die Bildung eines dichten Netzes schon in den ersten Tagen in vitro zu vermeiden. Bei der erwähnten Zellkonzentration, ist die Wahrscheinlichkeit des Findens isolierten Zellen mit einer längeren Neuriten nicht an andere Zellen verbunden viel höher.
3. Wulstbeschichtung
- Polymer-Mikrokugeln (Ø 4 um, COOH-terminierten-Bangs Laboratories, Produkt-Code PC05N/6700) wurden mit Poly-D-Lysin nach dem Verfahren in der Polylink Protein Coupling Kit (Polysciences, Produkt-Code 19539) beschrieben. Die Perlen werden mit dem gleichen Molekül verwendet werden, um die Kultur Unterstützung und für Zellen Haftung Abdeckung beschichtet.
4. Wählen Isolated Neuron. Trennen einer Perle aus der Kultur Substrat, Trap and Move it Neben dem Neuron
- Legen Sie die Kultur Petrischale am Mikroskop Bühne. Nach dem Setzen des Fokus auf der Probe durch Bewegung Bühne, korrigieren Sie die Position der leuchtenden Ziel Kondensator Kohler-Beleuchtung gesetzt. Ausrichten der Beleuchtung, um die Optik Kolher-Beleuchtung Bedingung ist nötig, damit die Hellfeldabbildung Qualität zu verbessern. Mit einer solchen Ausrichtung Bedingungen ist es auch notwendig, den IR-Laser Abscheidegrad (über Ziel Kondensator) zu maximieren, von der Streuung gefangen Sonde seiner interferometrischen Tracking der QPD und PD durchzuführen.
- Pipette ein paar ul des beschichteten Mikrokügelchen Stammlösung inder Kulturschale. Mikrosphären werden hinterlegen und sich an die Kultur Substrat. Die Zahl der ul in der Kulturschale injiziert hängt von der Konzentration der Mikrokügelchen Stammlösung. Der Idealzustand ist, zwischen einem und zwei Mikrosphären pro Bildgebung Sichtfeld haben. Wenn zu viele Mikrokugeln in die Kulturschale gegeben werden, können sie bereits zufällig Befestigung zu den kultivierten Neuronen.
- Bewegen Sie sich in der Kulturschale, die Suche nach einem isolierten Neuron mit einer längeren Neuriten (das Axon), und speichern Sie die Position des Mikroskops.
- Bewegen Sie sich und suchen Sie nach einem Wulst verklebt auf der Kultur-Unterstützung.
- Schalten Sie den IR Fanglaser. In diesem Stadium werden keine Hologramme auf SLM projiziert wird, und die Position des IR Laserpunkt fällt mit der UV Laserfleckposition. Stellen Sie die axiale Position der Stelle IR 2-3 um über der Kultur Auflagefläche durch Mikroskoptisch Bewegung.
- Stellen Sie den UV-Laser zugeführte Energie der Probe auf weniger als 1 uW. DieUV-Laser dissector wurde bisher 14 kalibriert:
5-6 uW der Glasträger abgetragen
4 uW eine neuronale Verbindung wird vollständig zerlegt
2,5 uW ein Neuriten teilweise lädierten wird
<1 uW eine Schockwelle in der Kulturschale hergestellt. Die optische Stoßwelle ist stark genug, um den Wulst von dem Glasträger zu lösen. - Schalten Sie die UV-Laser, während die IR-Laser auf, und verschieben Sie die UV-Stelle über dem eingehalten Wulst durch Mikroskoptisches Bewegung. Die Kügelchen löst sich von der Oberfläche, und es wird von dem IR-Laser gefangen. Dann schalten Sie den UV-Laser.
- Bewegen Sie die eingeschlossene Wulst mehrere Mikrometer über dem Glasträger (20-30 um). Anheben der Wulst zu dieser Position wird es von Kontakt mit anderen Zellen, während sie in Richtung des zuvor gewählten Neuron bewegt wird verhindern. Bringen Sie die Perle der zuvor gespeicherte Position der Bühne. Stellen Sie die Geschwindigkeit der Bühne auf einen niedrigen Wert (10 um / sec), so dass die Drag Fluidkraft nicht übersteigt optischen Falleping Kraft.
5. Bewegen Sie den Trap-Position in Bezug auf den Spot-und Laser Dissector Axon Position von Computer Generated Hologram und Kalibrieren der optischen Pinzette Steifigkeit
- Bewegen Sie den Wulst auf dem Glasträger auf das Axon zu visualisieren. Der Wulst über der Zelle gehalten kontaktiert zu (etwa 5 um über dem Glasträger) zu vermeiden.
- Bewegen des Mikroskops, um die UV-Fokuspunkt auf der Mitte der Breite des Axons zu bewegen. Speichern Sie die aktuelle Position der Bühne.
- Bewegen Sie den IR Fokusfleck Position computergenerierten Hologramms. In diesem Schritt wird die Phase, in der in dem vorhergehenden Schritt gewählt gestoppt. Wenn der Computer erzeugten Hologramm auf dem SLM projiziert wird, wird das eingeschlossene Wulst bezüglich der Axon bewegt. Wir ziehen die IR Laserpunkt haben die eingefangenen Wulst an der Mitte des Neuriten ausgerichtet ist, mit dem UV-Laser auf dem gleichen Fleck Neuriten zentriert zu. Die IR-Spot und damit die eingeschlossenen Wulst entlang der Neuriten positioniert5-10 um weg von der UV-Spot. Wir ziehen die Position des IR bezüglich der UV Ort in Abhängigkeit von der Geometrie Neuriten. Falls die optische Pinzette nicht mit einem SLM-System ausgestattet sind, kann die Position durch Kippen Spiegel, optische oder akustische Umlenkungen, auf der IR-Strahlengang variiert werden. Der IR-Laser Spot ist vielleicht 5-10 um positioniert weg von der UV-Punktstrahler, optische Wechselwirkung des Strahls mit dem Sezieren gefangen Sonde, die deren Brownsche Bewegung beeinflussen könnten und verändern die Kraftspektroskopie Spuren zu vermeiden.
- Nach der Definition des neuen IR Spot Position in Bezug auf UV-Spot-und Axon Position, bewegen die Bühne, um die eingeschlossene Wulst vom Axon positionieren und zu vermeiden Kollision mit ihm. Bewegen der axialen Position des eingefangenen Wulst zu etwa 2 um oberhalb des Deckglases.
- Richten Sie die QPD zum Zentrum die Interferenzstreifen darauf: x und y QPD differentielle Signale sind Nullen, wenn die QPD zentriert ist. Erwerben Sie 5 Sekunden von der Brownschen Bewegung der eingefangenen Wulst von der InterferometrieMeter, bei 50 KHz Abtastrate. Besorgen Sie sich die Steifigkeit (PN / nm) und Empfindlichkeit (V / nm) von der optischen Falle von dem Leistungsspektrum 18 Verfahren.
6. Befestigen Sie die Perle der Axon. Führen Axotomie und Simultaneous Kraftmessung
- Heben Sie den eingefangenen Wulstposition etwa 4 um über dem Deckglas und verschieben Sie sie in die zuvor gespeicherte Position der Bühne (siehe Schritt 3.2).
- Bewegen Sie den gefangen Wulst unten in Richtung der Axon bis sie die Neuriten. Die Kollision zwischen dem eingeschlossenen Wulst und dem Axon durch die z QPD Signal Erfassen einer Verschiebung des eingefangenen Wulst in axialer Richtung überwacht.
- Warten Sie 10 Sekunden mit dem eingefangenen Wulst geschoben gegen das Axon seine Haftung auf dem neurite Membran begünstigen.
- Bewegen der Mikrotisch um die gefangenen Wulst aus dem Axon verdrängen und damit die Prüfung seiner Haftung an der Zellmembran. Wenn der Wulst verklebt, entweicht es aus dem optischen Falle.
- Bringen Sie den Laserfalle am eingehalten Wulstund auf die Kraft-Clamp-Schleife mit Kraft Zustand gleich Null schalten. Auf diese Weise sind die Piezo-Stufe positioniert den Wulst, der an der Zelle auf der optischen Falle entfernt. Wenn das System nicht über eine Rückkopplungsschleife Steuerung kann die Laserfalle Position durch das Mikroskop Bühne zu zentrieren es auf der eingehalten Sonde bewegt. Das Zentrum des Abscheiders erreicht wird, wenn die QPD Signale die gleichen wie bei der Wulst eingeschlossen ist und nicht in die Zelle (x und y QPD Signale gleich Null ist, und die z QPD Signal gibt die gleiche Spannung Summe der vier Quadranten verklebt sind als wenn der Wulst weit von jeder Oberfläche eingeschlossen).
- Festlegen eines Kraft-Clamp Zustand auf der z-Achse, die Positionierung der Fanglaser etwas über der Mitte der Wulst (etwa 100 nm), um eine Vorspannung auf der haftenden gefangen Sonde zu erzeugen. Falls das System nicht mit einer Kraft-Klemme ausgestattet, kann die optische Falle Position nach oben in Schritten von 25 nm erhöht werden, indem dem Mikroskoptisch. Die z QPD Signal ermöglicht die Überwachung. Daher verwenden this Signal, um die Position des Laser-Falle in Bezug auf die Einhaltung Sonde einzustellen. Eine solche Vorspannung ist erforderlich, um die Belastung der Membran nach der axonalen Läsion, und die sich daraus ergebende Abnahme der Brownschen Bewegung des anhaftenden Sonde abzutasten. Ein ähnlicher Ansatz wurde auf die Messung der Freisetzung von Spannungen in einer Membran Halteseil von Video-Imaging 19 vorgeschlagen worden.
- Abschaltung der Kraft-Clamp-Feedback, um die Kraft auf die eingehalten Sonde in der Lage-Clamp-Zustand (der Piezo-Bühne wird blockiert) messen.
- Starten gleichzeitige Aufnahme der Sonde eingefangen Positionen durch das Interferometer (20 KHz Sampling-Frequenz) und der Zelle während der Laser Axotomie Zeitraffer Hellfeldaufnahme (20 Hz Bildrate).
- Schalten Sie die UV-Laser, Laser-Impulse liefern, bis eine Läsion sichtbar auf das Bild des Axons (in der Regel 200-400 optischen Impulse benötigt Energie pro Puls:. NJ 25), und schalten Sie dann die UV-Laser.
- Aufnahme fortsetzen durch das Interferometer für ca. 3 kmn, bis die x-, y-und z QPD Spuren ein Plateau erreicht.
7. Quantifizierung der insgesamt Spannungsstifte
- Konvertieren Sie die aufgezeichneten Spuren QPD (in Volt) durch die kalibrierte Empfindlichkeit der optischen Falle, um die jeweiligen Spuren in Nanometern zu erhalten.
- Filtern der x-, y-und z-Verschiebung Spuren durch ein Hochpassfilter mit bei 10 Hz geschnitten.
- Berechnen Sie die gesamte Varianz der gefilterten Spuren, die die Brownsche Bewegung der eingefangenen Perle. Berechnen Sie die Varianz bei 25 ms Schritten für überlappende Zeitfenster von 500 ms (10.000 Datenpunkte) 20. Die Hochpassfilterung Spuren schließt die Änderungen der Brownschen Bewegung durch die Membran Fluktuation oder kortikalen Aktin Bewegung. Die Brownsche Bewegung der Kugel durch die optischen Kräfte und die Adhäsionskräfte an der Zellmembran reduziert. Wenn die Membran aufgrund der Freisetzung von Spannungen seine Viskosität erhöht und damit die Brownsche Bewegung der Raupe wird gespannt, sofort erkanntbar nach Axotomie, zu sinken beginnt.
- Definieren t0: den Beginn der Abnahme der Brownschen Bewegung Varianz, nach der Lieferung von UV Laserenergie. Der Zeitpunkt t0 gibt den Beginn der Membran Stamm.
- Definieren t1: das Ende der Abnahme der Brownschen Bewegung Varianz (wenn es ein Plateau erreicht). Der Zeitpunkt t1 gibt das Ende der Membran Stamm.
- Führen Videotracking von Schmutz oder Kratzer auf der Abdeckung Glasträger, um jede Abweichung von der Probe während der Kraftmessung gemessen. Um die Teilchen auf dem Glasträger verfolgen wir zunächst gelten Schwellenwerte zu den Hellfeld-Bildern, um einen Stapel von binären Bildern mit dem Partikel in weiß auf schwarzem Hintergrund zu erhalten. Dann verfolgen wir das Teilchen Schwerpunkt mit Subpixel-Genauigkeit (unter Verwendung der Freeware ImageJ Software).
- Subtrahieren Sie die gemessene Drift aus den Hubraum QPD Spuren. Multiplizieren Sie die driftkorrigierten QPD Spuren durch den jeweiligen kalibrierten optischen Steifigkeit (k x, k
- Berechnen Sie die gesamte Kraft Spur als F ges = √ (Fx 2 + 2 + Fy Fz 2).
- Berechnen Sie die gesamte Freisetzung von Kraft zwischen t0 und t1 als F = F freigegeben tot (t1) - F tot (t0). Die Kraft, bei t0 gemessen wird, subtrahiert werden, da es aufgrund der Verschiebung der Sonde aus der Falle entfernt ist, wenn die Wulst haftet an der Neuriten.
- Berechnen Sie die Neuriten Kontaktfläche zwischen dem Wulst und dem eingeschlossenen UV Laserfleckposition: auf der Hellfeld Maßnahme die lange (L) und kurzen (D) Achsen des Neuriten zwischen dem Wulst und dem eingeschlossenen UV Laserfleckposition. Das Axon Kontaktfläche A Axon = L x D.
- Normalisieren der gesamt freigelassene Kraft F Freigabe durch das Axon Kontaktfläche A Axon.
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Representative Results
Die Zelle erzeugt Zugkräfte auf dem Substrat durch die fokalen Adhäsionen. Kraft durch Zytoskelett Elemente erzeugt werden, sind im Gleichgewicht mit der Gegenkraft der Kultur Substrat. Nach laserinduzierten Läsion des Neuriten, sind einige der gespannten Zytoskelett Kabel gestört und ihre äquilibriert Spannung befreit wird, da die Gegenkraft der Haftung auf dem Substrat eliminiert wird. Das freigesetzte Spannung teilweise auf die nicht betroffenen fokalen Adhäsionen verteilt und die Wulst an der Zellmembran in einer optischen Falle gehalten wird, misst den Anteil der Freisetzung nicht Cytoskelettelemente Verankerung der Zellen an das Substrat entgegengewirkt (siehe Schema 1) .
Wir berichten, in 2 wird ein repräsentatives Ergebnis der oben beschriebenen Versuchsprotokoll. Das Neuron in Abbildung 2a linken Fensterbereich zeigt eine längere Neuriten, die das Axon der Differenzierung n identifizierteuron. In 2a rechten Bereich wird die gleiche Neuron nach der induzierten axonale Läsion (angedeutet durch den weißen Pfeil) gezeigt. 2b zeigt die aufgezeichneten Spuren Wulst Verschiebung in x-, y-und z-Richtung. 2c meldet Videotracking eines Kratzers auf dem Glasträger zu berücksichtigen, und die Beseitigung der Stufe Drift während der Messung.
In Abbildung 3a, auf der linken Seite zeigen wir die lädierten Neuriten und die weiße Linie stromaufwärts der Läsion, wo wir berechnen die kymograph der Neuriten Durchmesser während der Spannung Freisetzungsmessung. Auf der rechten Platte ist die kymograph, zeigt, wie die Neuriten Durchmesser geringfügig erhöht sofort nach der Verletzung, und dann wird dünner aufgrund der Freisetzung von Spannungen in Richtung der Zelle soma. In 3b quantifizieren wir die kymograph Ergebnis. Die Neuriten heller erscheint in Bezug auf den Hintergrund, da wir die atta positioniertCHED Wulst im Fokus Mittelpunkt des Ziels und somit das Axon ist leicht unscharf. In der Tat, durch die Berichterstattung über die Summe der Pixel-Intensitäten entlang der Linie kymograph bei jedem Rahmen der Zeitraffer-Video-Aufnahme, so erhalten wir eine Schätzung der Neuriten Durchmesser während der Freisetzung von Spannungen. Am Panel 3c, berichten wir über die gesamten Varianz der angehängten Perlen während die Spannung zu lösen, berechnet auf der Grundlage der Spuren durch das Interferometer (in Abbildung 2b) nach Hochpaßfilterung bei 10 Hz Grenzfrequenz aufgezeichnet. Wir beobachten, dass die Varianz der Neuriten Durchmesser sich während der Akkumulation von Material vor der Läsion. Dann beginnt die Varianz zu verringern (zum Zeitpunkt t0 in Fig. 3c), wenn die Membran belastet ist, und die Neuriten abnehmendem Durchmesser zu. Die Varianz Abnahme ein Plateau erreicht (bei t1 in Abbildung 3c), wenn die Spannung Release aufhört. Nach t1, beginnt die Brownsche Bewegung zu erhöhen, weilder Membran Entspannung möglicherweise aufgrund Exozytose 21 (siehe Abbildung 3c).
In Abbildung 4a, zeigt das weiße Feld die Schätzung der Neuriten Kontaktfläche A Axon mit der Kultur zu unterstützen. Ein Axon zwischen der UV Laserfleckposition und dem Zentrum des eingefangenen Sonde berechnet. 4b Berichte der Amplitudenverlauf des gesamten freigegeben Kraft F Freigabe nach dem Multiplizieren des driftkorrigiert QPD Verschiebung Spuren (in Fig. 2b) der jeweiligen kalibrierten erhalten optische Falle Steifigkeit (k x, k y, k z). Wir berechnen die Differenz zwischen Kraft zum Zeitpunkt t1 und t0 (ΔpN in Abbildung 4b) gemessen, und dann teilen wir durch A Axon, um die Spannung in Bezug auf pN / um 2 veröffentlicht erhalten.
Durch Wiederholen des gleichen Protokolls auf verschiedenen Neuronen in der Probe können wir startenSitzungen von Experimenten an verschiedenen Kulturen mit chemischen Faktoren behandelt oder beschichtet auf unterschiedlichen Trägern, und schließlich einen Vergleich der durchschnittlichen Wert in den unterschiedlichen experimentellen Bedingungen erhalten. In Abbildung 5 zeigen wir die Freisetzung von Spannungen nach axonaler Läsion durch fokale Adhäsionen auf dem Substrat wird gedämpft, wodurch eine höhere Spannung Release-Wert bedeutet ein Axon weniger auf das Substrat geklebt. Da wir einen Teil und nicht vollständig, Läsion des Axons zu induzieren, untersuchten wir die Abhängigkeit der gemessenen Spannung Freisetzung auf die gesamte gelieferte Energie und auf der Neuriten Kontaktfläche zwischen der Läsion und der eingeschlossenen Kügelchen. Wir wollten mehr Cytoskelettelemente durch die Bereitstellung einer größeren Anzahl von Lichtimpulsen zu zerstören und damit zu induzieren eine höhere Freisetzung von Spannungen. Ansonsten mit einem erhöhten neurite Kontaktfläche, erwarteten wir eine geringere Menge an Spannung Release messen. In Abbildung 5 zeigen wir, dass die Abhängigkeit von den beiden oben genannten Parameter istnicht klar. Daher abgeleitet wir, dass die induzierte partielle Läsion (mit der zuvor kalibrierten niedriger Energie pro Impuls, siehe Protokoll Schritt 4.5) um die Dimension der Ablation Punkt 8, der sich nicht ändert, wenn mit der gleichen Mikroskopobjektiv und die gleiche Energie zusammenhängt pro Impuls auf die Probe. Darüber hinaus ist die Tatsache, dass die Freisetzung von Spannungen nicht auf die Kontaktfläche korreliert nicht verwunderlich, denn es ist bekannt, dass solche Parameter repräsentieren nicht eine gute Schätzung der Zelle Haftung auf dem Substrat, wie fokalen Adhäsionen nur 1% der zu besetzen Grundflächenbereiche 22.
Abbildung 1. Grafische Darstellung des Zytoskeletts gestört Gleichgewicht beim Laser Axotomie. Zelle hält sich an einem Substrat durch fokale Adhäsionen. Blaue Pfeile specify Zugkräfte von Zytoskelett-Elemente (durch Federn) generiert. Light-blauen Pfeile zeigen die Gegenkräfte durch die starre Kultur Substrat erzeugt. In einer vereinfachten Szenario vor Läsion werden die Zytoskelett-und Substrat Kräfte gekoppelt und äquilibriert. Nach laserinduzierten Läsion des Neuriten, sind die Verbindungen zwischen einigen Quellen und dem Substrat gestört. So ist das Substrat nicht mehr entgegenwirkt Zugkraft des cytoskletal Element. Die eingeschlossene Wulst an Membran bildet die Richtung der Freigabe Zytoskelett Kräfte.
Abbildung 2. Interferometrische Tracking eines eingeschlossenen Kügelchen, die an der Membran des Axons eines Hippocampus während laserinduzierten Läsion. (A) Hellfeld Bilder erworben während der Ablation von einem Axon. Vor der Läsion auf der linken Seite. Nach der Läsion auf der rechten Seite. Ein Poly-D-Lysin-beschichtete Kügelchen an der Membran (polystirene Wulst, Ø 4 um) befestigt ist und in einer optischen Falle. Mittlere Leistung des IR-Laser an der Probe beträgt 14 mW. Weißer Pfeil zeigt die Läsion. Bar ist 5 um. (B) Aufgezeichnete Spuren hinteren Brennebene Interferometrie der Raupe Position in der optischen Falle. Blau, Grün und Rot Spuren repräsentieren den Wulst entlang x, y und z-Achse. Abtastrate 20 kHz ist. (C) Versetzung eines Kratzers auf die Kultur Unterstützung durch Video-Tracking gemessen, um die Bühne Drift überwachen. Blaue und grüne Spuren sind die x-und y-Positionen durch Video-Tracking erhalten. Bildrate beträgt 5,5 Hz.
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Abbildung 3. Analyse der Axondurchmesser während die Spannung zu lösen, und der Membran Stamm des lädierten Axon. (A) Hellfeld Bild des lädierten Axon, auf der linken Seite. Die weiße Linie senkrecht zu der Axon zeigt die Position, wo ein kymograph berechnet. Auf der rechten Platte, kymograph der Axondurchmesser, vor der Läsion. Jede Zeile der kymograph entspricht 0,18 sec. (B) Summe der Pixelintensitäten jeder Zeile der kymograph die eine Schätzung des Axondurchmesser während die Spannung zu lösen. (C) insgesamt Varianz der Brownschen Bewegung der Raupe auf die beigefügten Axon (t0 und t1 bezeichnen jeweils den Anfang und das Ende der Spannungen Release im Axon nach Dissektion).
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Abbildung 4. Quantifizierung der Spannung nach Axotomie veröffentlicht. (A) Hellfeld Bild des lädierten Axon. Der weiße Kasten zeigt die Schätzung des Neuriten Kontaktfläche zwischen der Läsion und dem Zentrum des eingefangenen Wulst. (B) Trace der gesamten Amplitude der Kraft nach Axotomie (F ges = √ (Fx 2 + 2 + Fy Fz gemessen 2)). Fx, Fy, und Fz wurden von Hooke-Gesetz (F = kx), wo die Verschiebung Spuren sind es, die in 2b gezeigt berechnet. Die Steifigkeiten in den drei orthogonalen Richtungen der optischen Falle wurden von der Leistungsspektrum-Verfahren (k x, y = 7,9 PN / um, k z = 2,3 PN / um) berechnet. ΔpN zeigt die gemessene freigegeben Kraft zwischen dem Zeitpunkten t0 und t1.
Abbildung 5. Abhängigkeit der gemessenen Spannung Release auf die Menge an Energie, die auf die Probe, auf der Neuriten Kontaktfläche. Daten aus 26 Versuchen an den Axonen von Neuronen Maus hippocamapal bei 3 DIV durchgeführt. (A) Streudiagramm der Spannung Release gegenüber neurite Kontaktfläche zwischen Läsion und gefangen Perle Standorten. (b) Streudiagramm der Spannung Release gegenüber Gesamtmenge der zugeführten Energie auf die Probe neurite Kontaktfläche.
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Discussion
Wir berichten in dieser Arbeit eine quantitative Methode, um die Neuriten Haftung auf dem Substrat Kultur vergleichen, indem Sie gleichzeitig Kraft-Spektroskopie Messung während laserinduzierten Zelle Läsion. Die gemessene Freisetzung von Spannung auf den Grad der Haftung der Zellen an das Substrat bezogen werden: Zellen mit einer höheren Anzahl von fokalen Adhäsionen zu weniger Verspannungen. Die Messung der Freisetzung von Spannungen in Bezug auf Pikonewton bietet eine physikalische Größe, durch die die axonale Haftung für die Kultur-Unterstützung zu beurteilen in verschiedenen experimentellen Bedingungen 14.
Mehrere Labors integriert einen Laser dissector mit einer optischen Pinzette System Annahme deutlichen optischen Designs 23. Unsere Wahl fiel auf ein Setup mit fester Strahlengang und Mikroskoptisches Bewegung. Um dies zu erreichen, stellen wir einen räumlichen Lichtmodulator in dem IR-Laser Strahlengang das Einfangen Stelle in Bezug auf die UV-Laser zu bewegen. Obwohl galvanometric Spiegel ermöglichen die Steuerung des Laser-Fokus Position ohne Bewegung der Probe, können sie mechanische Geräusche in der Anlage, die die Kraft-Spektroskopie Messungen einzuführen. Darüber hinaus haben wir beschlossen, neu zu positionieren die IR Laserfokus in der Probe, da die Brownsche Bewegung Analyse erlaubt eine schnelle Re-Kalibrierung des optischen Steifigkeit. Bewegen des UV Laserfleckposition auf der Probe zu erzeugen sphärischen Aberrationen, die die Qualität des UV Brennfleck selbst, die vernachlässigbar sind nur für kleine Verschiebungen des Strahls von seiner zentralen Position. Daher könnte Änderung der optischen Eigenschaften des Lasers Dissektor erforderlich de novo Kalibrierung der abgegebenen Laserleistung gegen Beschädigung der Einheit.
Durch Kraft-Spektroskopie Messung, konnten wir beobachten, dass die Spannung Freisetzung eines schnellen Phase von ein paar Sekunden, und eine langsame Phase, die einige zehn Sekunden dauern könnte zusammengesetzt ist. Wie in früheren Arbeiten 14, manchmal die langsame gemeldetPhase könnte einige Minuten dauern. Aus diesem Grund mussten wir die Kraftmessung Video Tracking einen Kratzer auf der Kultur-Unterstützung zu korrigieren. In Zukunft wäre ein besserer Ansatz zu Stufe Drift mit einer Rückkopplungsschleife, die Auto-Korrektur die Mikroskoptisches Position durch Video-oder interferometrischen Verfolgung von einem Wulst an der Deckglas abzubrechen. Diese Art der Konfiguration, bereits in der Literatur berichtet, erfordert einen zweiten Laserstrahl auf dem beigefügten Wulst zentriert und sorgt Bühne Stabilisierung mit Sub-Nanometer-Präzision 24,25.
In Zukunft wollen wir die entwickelte Protokoll anwenden, um die Haftung an der axonalen Kultur Unterstützung vergleichen in verschiedenen Stadien der Differenzierung und in verschiedenen pathologischen Bedingungen, um eine quantitative Assay für pharmakologische Behandlung. Darüber hinaus könnte das gleiche Protokoll auf das Design von implantierbaren Gerüste gelten, um die neuronalen Haftung auf unterschiedlichen Arten von Materialien zu vergleichen mit deutlichen mechanischer oder chemischen Eigenschaften 26.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Alberto Guiggiani für die Entwicklung des Echtzeit-Steuersystem, Evelina Chieregatti und Hanako Tsushima für aufschlussreiche Diskussionen, Giacomo Pruzzo und Alessandro Parodi für die Entwicklung von kundenspezifischen Elektronik und Software, und Claudia Chiabrera und Marina Nanni für ihre kompetente Beratung und Unterstützung in der Zellkultur Vorbereitung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | Hamamatsu | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop | ||
References
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