Summary
מדדנו את שחרור המתח באקסון שlesioned באופן חלקי עם מבתר לייזר על ידי מדידת ספקטרוסקופיה כוח בו זמנית מבוצעת על בדיקה אופטית-לכודה דבקה הממברנה של האקסון. פרוטוקול הניסוי פיתחה מעריך את האקסון ההידבקות למצע התרבות.
Abstract
היווצרות של קשרים פונקציונליים עצבית ברשת פיתוח מושפעת על ידי רמזים חיצוניים. צמיחת neurite של נוירונים מתפתחים כפופה לאותות כימיים ומכאניים, והמנגנונים שבאמצעותם הוא חש ומגיב לאותות מכאניים הם הבינו היטב. הבהרת תפקידם של כוחות בהתבגרות תא תאפשר את העיצוב של פיגומים שיכולים לקדם את הידבקות תא וצימוד cytoskeletal למצע, ולכן לשפר את היכולת של סוגים שונים עצביים להתחדש לאחר פציעה.
כאן, אנו מתארים שיטה ליישם מדידות ספקטרוסקופיה כוח בו זמנית בנגע תא מושרה לייזר. אנו מודדים את שחרור מתח באקסון באופן חלקי על ידי מעקב lesioned interferometric סימולטני של חללית לכודה אופטי דבקה הממברנה של האקסון. פרוטוקול הניסוי שלנו מזהה את שחרור המתח עם רגישות piconewton, והדינמיקה של שחרור המתח ברזולוציה זמן אלפית השנייה. לכן, היא מציעה שיטת רזולוציה גבוהה ללמוד איך הצימוד מכאני בין תאים ומצעים יכול להיות מווסת על ידי טיפול תרופתי ו / או על ידי תכונות מכאניות שונות של המצע.
Introduction
מיקרוסקופיה אופטית היא אחד ממערכת ההדמיה פחות פולשנית זמינה להתבונן תאי חיים. עם הניצול של תופעות כגון לחץ קרינה (כמו בפינצטה האופטית 1), או שטף פוטונים באנרגיה גבוהה (כמו בליזר המבתר 2), טכנולוגיה זו הוארכה עד ננו מניפולציה. מערכת ההדמיה האופטית מספקת שליטה מדויקת לדמיין ולתפעל מטרות הסלולר משנה 3. באותו הזמן, הודות לכיול מדויק של כוח לייזר נמסר, כלים אופטיים להשיג או מניפולציה מדגם רכה או פולשני עם שחזור חסר תקדים.
מספר מעבדות משולבות, באותה הגדרת ניסוי, פינצטה אופטית וליזר מבתר כדי לקטוע האברונים 4, לפתיל יחד 5 תאים שונים, או כדי לעורר את התאים על ידי מטענים מונעים אופטי 6,7. בעוד פינצטה אופטית, לאחר כיול של הקשיחות האופטית, תאפשרהשליטה הפעיל כוח לתא בקנה מידת piconewton, מערכות לייזר לנתיחה יכולה לווסת את המניפולציה אופטית, שנעה בין קרום צילום poration לאבלציה של אברונים או נתיחה בודדות של מבנים תת סלולריים. עם זאת, כיול נתיחת לייזר מסתמך על הערכה איכותית של הישות של מניפולציה אופטית ביחס לאנרגיה שנמסרה למדגם, המבוססת בעיקר על ניתוח תמונה הממחיש את השינויים מורפולוגיים שנגרמו לדגימת 8. בשיטה שהוצגה, אנו מדגימים כיצד לבצע מדידת ספקטרוסקופיה תוקף במהלך נתיחת axonal לייזר של נוירון פיתוח, לכמת, בקנה מידת piconewton, הכח הנוצר על ידי שיווי משקל משתנה במבנה שלד התא של תא משנה הסלולר 9. נוירונים בתרבית לדבוק במצע, ולקטב במהלך פיתוח. שלב הקיטוב מתרחש במהלך חמשת הימים הראשונים במבחנה. בשלב שתיים של קיטוב, אחד extrudneurites ing הופך ארוך יותר, וזה יהיה להבדיל להפוך האקסון 10. התארכות axonal בתגובה לכוח הגרירה בחרוט הצמיחה כבר דגם בעבר על ידי המודל של Dennerl 11. לאחרונה, מודל זה הורחב כדי לכלול 12 את התפקיד של הידבקות neurite למצעי מטריקס. מודל biophysical זו, מוצע לאחר תצפיות ניסיוניות 13, הראה כי משיכת כוחות על חרוט צמיחה, מתפשטת לאורך neurite, הם מווסת על ידי הידבקויות מוקד למצע. כמו כן, נגע axonal מייצר שחרור מקומי של מתח מתפשט לכיוון גוף התא. לפיכך, אנו מציעים כי מדידת מתח שוחרר כזו במיקום לאורך האקסון בין הנגע וסומה התא מציעה את האפשרות להעריך את סיכויי הריסון של הידבקויות מוקד שלא נפגעו.
אנו מכיילים את האנרגיה הדרושה פוטון-השטף של מבתר לייזר כדי לשלוט על היקף damag axonal נגרמהדואר, מחיתוך רוחב מלא לנגע חלקי. בעקבות הכיול, אנחנו חזרתי באופן חלקי לנגע את האקסונים של תאי עצב כמה מבדילים ופיתח את הפרוטוקול לכמת את שחרור המתח, וקיבל פרמטר הכמותי לאמוד את ההידבקות של האקסון למצע ובכך 14.
בעבודה הנוכחית, אנו מתארים בפירוט את הפרוטוקול פיתחה, המייצג את הליך ניסוי מדויק כדי להעריך ולהשוות עם רגישות piconewton הידבקות axonal למצע בתנאים שונים ניסיוניים כגון טיפול כימי 14, או סוגים שונים של תמיכת תרבית תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. התקנה אופטית
המערכת האופטית כל שתוארה קודם לכן 15. בקצרה, המערכת האופטית פינצטה מבוססת על גל רציף איטרביום (CW) הפעלה לייזר סיב ב 1064 ננומטר (IPG לייזר GmbH). מרחבי אור מאפנן (SLM) (LCOS-SLM, מודל X10468-07 - Hamamatsu) משתנה השלב של קרן לייזר אינפרא אדום נכנסת לשליטה במיקום של נקודת פוקוס ההשמנה על צלחת התרבות על ידי הולוגרמות שנוצרו במחשב. את התוכנה (קישור אינטרנט על שולחן ציוד) הולוגרמות שנוצרו זמינות באופן חופשי Blue-פינצטה מוקרנות על מאפנן אור מרחבי. אינטרפרומטר למדידות ספקטרוסקופיה כוח היה מבוסס על photodiode ארבע רבע (QPD, S5980 עם C5460SPL 6041 לוח - Hamamatsu) וphotodiode (פ"ד, PDA100A-EC - Thorlabs).
מקור נתיחת לייזר היה Nd UV תת שבריר שנייה פעם: YAG לייזר ב355 ננומטר (PNV-001,525-040, PowerChip ננו דופק UV לייזר - Teem Photonics). Acousto-אופטי מאפנן (MQ110-A3-UV, 355 ננומטר התמזגו סיליקה-AA-Opto-אלקטרוני) שלט בכוחו של לייזר UV נמסר למדגם.
האופטית הולוגרפית פינצטה ולייזר מייקר המבתר שולבו במיקרוסקופ זקוף שונה (BX51 - אולימפוס) מצוידים ב60x, NA מים 0.9 טבילת שלב objective.The של המיקרוסקופ מורכב מיניארי 3 ציר מנוע DC מייקר מיצוב המערכת (M-126.CG1, פיסיקה, מכשירים) ביצוע שלב ננו מיצוב נפרד 3 ציר פיזואלקטריים (P-733.3DD, פיסיקה, מכשירים) לשלב תנועה גסה של המדגם עם הרזולוציה משנה ננומטר של פייזו במה. מערכת הבמה מיקרוסקופ הייתה מצוידת בשתי לולאות בקרת סינרגיה פועל כדי לשמור על נקודת מיקוד ההשמנה במיקום הנכון, בהתאם למצב העבודה שנבחר (או מהדק עמדת כוח, סטטית או דינמית) 16. בפרט, לולאת משוב פנימית פועלת על במה פיזואלקטריים, כדי לשמור על חרוז בבחרמרחק אד ממרכז המלכודת. הלולאה החיצונית האחרת שולטת על מיקום הבמה הממונעת לנצל את האזור נחצה על ידי פייזו מפעיל בשטח גדול יותר מאשר 17 השבץ זמין שלה. כאשר פייזו השלב מגיע לגבול של השבץ זמין בכיוון אחד, הלולאה החיצונית עוברת שלב מיקרו בכיוון ההפוך, ובכך piezo מתאוששת לקראת המיקום המרכזי שלו, כי זה הוא מעקב חרוז לכוד דבק במדגם. כאשר פייזו השלב מגיע למצב של הטווח כמובן המרכזי, שלב מיקרו הופסק. פרטים נוספים על המערכת מדווחים בGuiggiani אח' 16,17.
מכשיר פלטייה (חימום QE1 התנגדות עם בקר מחמם ערוץ כפול TC-344B - וורנר מכשירים) שולט בטמפרטורה של תרבית התאים תחת מיקרוסקופ (37 מעלות צלזיוס). בתרבות, חומציות ולחות נשמרו בתנאים פיסיולוגיים על ידי הגזת polydimethyl האישי מעוצבשרוול siloxane (PDMS) (שילוב מטרת מיקרוסקופ) עם carbogen humidified (95% O 2, 5% CO 2).
2. הכנת תרבית תאים
כל פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי משרד בריאות האיטלקי. תרבויות העיקריות התקבלו מhippocampi של עכברים (C57BL6J, צ'ארלס ריבר) ביום עוברי 18 (E18).
- הנוירונים היו מצופה בריכוז של 25,000 תאים / מ"ל בצלחות פטרי זכוכית תחתונה (P35G-0-14-C - תאגיד Matek). הריכוז הנמוך של תאים בתרבית שדרוש כדי למנוע היווצרות של רשת צפופה כבר בימים הראשונים במבחנה. בריכוז התא האמור, את הסיכוי למצוא תאים מבודדים עם neurite כבר לא מחובר לתאים אחרים הוא הרבה יותר גבוה.
3. ציפוי חרוז
- פולימר microspheres (O 4 מיקרומטר, מעבדות COOH-הסתיים-בנגס, קוד מוצר PC05N/6700) היו מצופה בפולי-D-ליזין בעקבות ההליך המתואר בpolyLink חלבון צימוד קיט (Polysciences, קוד מוצר 19539). החרוזים מצופים באותה המולקולה המשמשת לכיסוי תמיכת התרבות והידבקות תאים טובה.
4. בחר Neuron מבודד. ניתוק מחרוז תרבות המצע, מלכודת ולהעביר אותו לצד Neuron
- שים את צלחת פטרי התרבות על הבמה מיקרוסקופ. לאחר הגדרת ההתמקדות במדגם על ידי תנועת במה, לתקן את עמדתו של הקבל האובייקטיבי המאיר להגדיר קולר-תאורה. יישור אופטיקה התאורה כדי להגדיר את מצב Kolher-התאורה הוא הכרחי על מנת לשפר את איכות ההדמיה השדה בהירה. באמצעות תנאי יישור כאלה, זה גם הכרחי על מנת למקסם את יעילות גביית לייזר IR (דרך הקבל אובייקטיבי), מבדיקת פיזור הלכודים, לבצע מעקב interferometric על ידי QPD ופרקינסון.
- פיפטה כמה μl של פתרון מניות microsphere המצופה בלמנת התרבות. Microspheres תפקיד ולדבוק במצע התרבות. מספר μl מוזרק לתוך צלחת התרבות תלויה בריכוז microsphere של פתרון המניות. המצב האידיאלי הוא שיש בין אחת לשתיים microspheres לתחום ההדמיה של נוף. כאשר יותר מדי microspheres מתווספות למנת התרבות, הם כבר יכולים לצרף באופן אקראי לתאי העצב בתרבית.
- להסתובב בצלחת התרבות, מחפש נוירון מבודד עם neurite ארוך יותר (האקסון), ולשמור את המיקום של הבמה מיקרוסקופ.
- להסתובב ולחפש את חרוז דבק בתמיכת התרבות.
- הפעל את לייזר השמנת IR. בשלב זה, אין הולוגרמות מוקרנת על SLM, ואת עמדתו של כתם לייזר IR עולה בקנה אחד עם עמדתו כתם לייזר UV. הגדר את המצב הצירי של מקום IR 2-3 מיקרומטר מעל פני השטח תמיכת התרבות, על ידי תנועת הבמה מיקרוסקופ.
- הגדר את כוח לייזר UV נמסר למדגם לμW פחות מ 1.UV לייזר מבתר כבר מכויל 14 בעבר:
5-6 μW תמיכת זכוכית ablated
4 μW חיבור עצבי הוא גזור לחלוטין
2.5 μW neurite הוא lesioned באופן חלקי
<ΜW 1 גל הלם מיוצר בצלחת התרבות. גל ההלם האופטי הוא חזק מספיק כדי לנתק את חרוז מתמיכת הזכוכית. - הפעל את לייזר UV, תוך השארת לייזר IR ב, ולהעביר את מקום UV מעל חרוז דבק על ידי תנועת הבמה מיקרוסקופ. לניתוק מהחרוז לפני השטח, והוא נלכד על ידי לייזר אינפרא אדום. לאחר מכן, כבה את לייזר UV.
- הזז את מיקרומטרים אחדים חרוז הלכוד מעל תמיכת הזכוכית (20-30 מיקרומטר). הרמת חרוז לתפקיד זה יהיה למנוע ממנו ליצור קשר עם תאים אחרים בזמן שהוא נע לעבר תא העצב שבחר בעבר. להביא את חרוז למיקום הבמה נשמר בעבר. הגדר את מהירות הבמה לערך נמוך (10 מיקרומטר / שנייה) ולכן כוח גרר הנוזל אינו עולה על המלכודת האופטיתפינג כוח.
5. להזיז את מיקום מלכודת ביחס לנקודת לייזר המבתרת ומיקום על ידי אקסון הולוגרמה מחשב שנוצר, וכייל את נוקשות פינצטה האופטיות
- הזז את חרוז הזכוכית לכיוון התמיכה כדי להמחיש את האקסון. חרוז מתקיים מעל לתא כדי להימנע ממגע עימו (כ -5 מיקרומטר מעל תמיכת זכוכית).
- הזז את הבמה מיקרוסקופ כדי להזיז את נקודת מוקד UV במרכז הרוחב של האקסון. שמור את מיקום השלב הנוכחי.
- העבר את מיקום נקודת מיקוד IR ידי הולוגרמה ממוחשבת. בשלב זה, השלב ייעצר בעמדה שבחרה בשלב הקודם. כאשר ההולוגרמה שנוצרה המחשב מוקרנת על SLM, חרוז הלכוד מועבר ביחס לאקסון. אנחנו עוברים את נקודת לייזר אינפרא אדום יש חרוז הלכוד מיושר במרכז neurite, עם כתם לייזר UV מרוכז באותו neurite מדי. מקום IR וכך חרוז הלכוד מוצבים לאורך neuriteמיקרומטר 5-10 הרחק מהמקום UV. אנחנו עוברים את העמדה של IR ביחס לנקודת UV בהתאם לגיאומטרית neurite. במקרה את פינצטה האופטית אינן מצוידת במערכת SLM, יכולה להיות מגוונת על ידי עמדת מראות הטיה, או deflectors אופטי אקוסטיות, על הנתיב האופטי IR. כתם לייזר IR עשוי להיות ממוקם מיקרומטר 5-10 מהמקום UV כדי להימנע מאינטראקציה אופטית של הקרן לנתח עם החללית הלכודה, שיכול להשפיע על התנועה הבראונית שלה ולשנות את עקבות ספקטרוסקופית בכוח.
- לאחר שהגדיר את מיקום נקודת IR החדש ביחס למקום UV ועמדת האקסון, להעביר את הבמה למצב את חרוז לכוד מהאקסון ולהימנע מהתנגשות עימו. העבר את המיקום הצירי של חרוז לכוד לכ -2 מיקרומטר מעל מכסה הזכוכית.
- יישר QPD למרכז לשולי ההפרעה על זה: X ואותות דיפרנציאליים QPD y הם אפסים כאשר QPD מרוכז. תרכוש 5 שניות של התנועה הבראונית של חרוז לכוד על ידי interferoמטר, בקצב דגימת 50 קילוהרץ. השג את הנוקשות (PN / ננומטר) ורגישות (V / ננומטר) של המלכודת האופטית בשיטת ספקטרום כוח 18.
6. צרף את חרוז לאקסון. לבצע מדידת חיל Axotomy וסימולטני
- הרם את עמדת חרוז הלכוד כ -4 מיקרומטר מעל מכסה הזכוכית, ולהעביר אותו למצב שנשמר בעבר הבמה (ראה שלב 3.2).
- הזז את חרוז לכוד כיוון האקסון עד שהוא קשר neurite. ההתנגשות בין חרוז הלכוד והאקסון היא פיקוח על ידי אות Z QPD גילוי תזוזה של חרוז לכוד בכיוון הצירי.
- חכה 10 שניות עם חרוז הלכוד דחף נגד האקסון להעדיף הידבקותה לneurite הקרום.
- הזז את שלב מיקרו כדי לעקור את חרוז לכוד מהאקסון, ובכך לאמת את הידבקותה לקרום התא. אם דבק חרוז, הוא בורח מהמלכודת האופטית.
- מעבר אחורה מלכודת לייזר על החרוז דבקולעבור בלולאה בכוח מלחציים עם מצב כוח שווה לאפס. באופן כזה, ממקם מחדש piezo השלב חרוז, שצורף לתא, במרכז המלכודת האופטי. אם המערכת לא קיים בקרת משוב לולאה, ניתן להעביר את מיקום מלכודת לייזר על ידי הבמה מיקרוסקופ למרכזו על החללית דבקה. מרכז המלכודת הוא הגיע כאשר אותות QPD הם זהים כאשר חרוז הוא לכוד ולא פעלה בהתאם לתא (x ו-y אותות QPD שווים לאפס, וz QPD האות נותן את אותו הסכום של ארבעת הרביעים מתח כאשר חרוז הוא לכוד רחוק מכל משטח).
- הגדרת מצב כוח מהדק על ציר Z, מיצוב לייזר ההשמנה מעט מעל המרכז של חרוז (כ -100 ננומטר), כדי ליצור יומרה על הבדיקה לכודים דבקה. במקרה שהמערכת אינה מצוידת בבקרת כוח מהדק, ניתן להעלות את מיקום המלכודת האופטי בשלבים של 25 ננומטר בבמת מיקרוסקופ. אות QPD z מאפשרת ניטור. לכן, להשתמש thiים לאותת כדי לקבוע את המיקום של מלכודת לייזר ביחס לחללית דבקה. יש צורך במתח כזה מראש כדי לחוש את הלחץ על הקרום לאחר נגע axonal, והירידה הסוגר של תנועה הבראונית של החללית דבקה. גישה דומה הוצעה למדידה על שחרורו של מתח ברצועה על ידי קרום סרטון הדמיה 19.
- כיבוי משוב כוח המהדק כדי למדוד את כוח בחללית דבקה בעמדת מצב המהדק (פייזו השלב חסום).
- להתחיל בהקלטה בו זמנית של עמדות הבדיקה שנלכדו באמצעות אינטרפרומטר (20 קילוהרץ תדר דגימה), והתא במהלך ההדמיה בהירת שדה לייזר axotomy זמן לשגות (במסגרת שיעור הרץ 20).
- הפעל את לייזר UV כדי לספק פעימות לייזר עד נגע הופך לגלוי בדמותו של האקסון (בדרך כלל 200-400 פולסים אופטיים יש צורך באנרגיה לכל דופק:. NJ 25), ואז לכבות את לייזר UV.
- המשך הקלטה על ידי אינטרפרומטר כ 3 מיילn, עד x, y ועקבות QPD z להגיע לרמה.
7. לכמת לשחרר מתח סה"כ
- להמיר את עקבות QPD המוקלטות (בוולטים) על ידי הרגישות מכוילת של המלכודת האופטית, כדי להשיג את העקבות המתאימות בננומטרים.
- סנן את x, y, z ועקבות תזוזה על ידי לעבור סינון גבוה עם נחתך ב -10 הרץ.
- לחשב את סך השונות של עקבות המסוננות המייצגות את התנועה הבראונית של חרוז הלכוד. חישוב השונות במהירות של 25 צעדי msec לחפיפת הזמן של Windows של 500 אלפיות שני (10,000 נקודות נתונים) 20. הגבוהה לעבור סינון של עקבות אינו כולל את השינויים של תנועה הבראונית בשל תנודות קרום או תנועה אקטין קליפת המוח. התנועה הבראונית של חרוז היא מופחתת על ידי הכוחות האופטיים וכוחות ההדבקה על קרום התא. כאשר הקרום מתוח בגלל שחרורו של מתח הצמיגות שלה היא גדל, ולכן התנועה הבראונית של חרוז, היא מיד זיהומצוי לאחר axotomy, מתחיל לרדת.
- הגדר t0: תחילת הירידה של שונות התנועה הבראונית, לאחר המסירה של אנרגיה לייזר UV. T0 מיידי הזמן מציין את תחילתו של מתח קרום.
- הגדר T1: סוף הירידה של שונות התנועה הבראונית (כאשר הוא מגיע לרמה). T1 מיידי הזמן מציין את סופו של מתח קרום.
- לבצע מעקב וידאו של פסולת או שריטה על תמיכת מכסה הזכוכית, כדי למדוד כל סחיפה של המדגם במהלך מדידת כוח. כדי לעקוב אחר החלקיק על תמיכת הזכוכית, עלינו תחילה להחיל ספים לתמונות בהירות השדה, כדי לקבל ערימה של תמונות בינאריות עם החלקיקים בצבע לבן על רקע שחור. לאחר מכן, אנו עוקבים אחר מרכז מסה של חלקיקים עם דיוק תת פיקסל (באמצעות התוכנה החופשית ImageJ).
- הפחת את הסחיפה נמדדת על פי עקבות QPD עקירה. הכפל את עקבות QPD להיסחף-תוקנו על ידי הנוקשות אופטיות מכוילת בהתאמה (k X, K
- לחשב את עקבות כוח מוחלטת כמו F טוט = √ (Fx 2 + 2 + Fz פ.י. 2).
- לחשב את שחרורו המוחלט של כוח בין t0 וT1 כמו F = F טוט שוחרר (T1) - F טוט (t0). יש כוח שנמדד בt0 להיות מופחת כי זה נובע מהתזוזה של החללית ממרכז המלכודת, כשאת שומרת חרוז neurite.
- לחשב את שטח המגע בין neurite חרוז לכוד ואת מיקום נקודת לייזר UV: על המידה את התמונה בשדה בהירה (ד ') צירים ארוכים (L) וקצרים של neurite בין חרוז לכוד ואת מיקום נקודת לייזר UV. שטח מגע האקסון הוא האקסון = אורך x ד
- לנרמל את כוח F הכולל שוחרר שוחרר על ידי אזור האקסון קשר האקסון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התא מייצר כוחות המתיחה על המצע על ידי הידבקויות המוקד שלה. כוח שנוצר על ידי גורמי cytoskeletal נמצא בשיווי משקל עם כוח מנטרל את המצע של התרבות. לאחר נגע לייזר המושרה של neurite, חלק מכבלי cytoskeleton נדרכו הם שיבשו ומתח equilibrated הוא שוחרר בגלל כוח הנגדי של הידבקות המצע מתבטל. המתח שוחרר מופץ באופן חלקי על הידבקויות מוקד שלא נפגעו, והחרוז מצורף קרום התא, שהתקיים במלכודת אופטית, מודד את החלק של שחרור כזה לא נוטרל ע"י אלמנטי cytoskeletal עיגון התא למצע (ראה איור 1 סכמטי) .
אנו מדווחים, באיור 2, תוצאת נציג של פרוטוקול הניסוי שתואר לעיל. נוירון, בפנל שמאלי איור 2a, מציג עוד neurite, המזהה את האקסון של n ההבחנהeuron. בפנל ימני איור 2a, אותו תא העצב מוצג אחרי נגע axonal המושרה (מסומן בחץ הלבן). איור 2b מראה את עקבות התזוזה חרוז נרשמו בx, y, z וכיוונים. איור 2 ג מדווח מעקב וידאו של שריטה על תמיכת הזכוכית, לקחת בחשבון ולמנוע את סחף הבמה במהלך המדידה.
באיור 3 א, בפנל השמאלי, אנו מראים neurite lesioned, וקו הלבן במעלה הזרם אתר נגע, שבו אנו מחשבים את רשם גלים של קוטר neurite במהלך מדידת שחרור המתח. בפנל הימני הוא רשם גלים, מראים כיצד קוטר neurite מעט מגדיל מייד לאחר הפגיעה, ולאחר מכן הופך להיות דק יותר עקב השחרור של מתח לקראת סומה התא. באיור 3 ב, אנו לכמת את תוצאת רשם גלים. Neurite נראה בהיר לגבי הרקע מאז שממוקמים אתאCHED חרוז במרכז המיקוד של המטרה, ולכן האקסון הוא קצת מחוץ לפוקוס. ואכן, על ידי דיווח על הסכום של עוצמות פיקסל לאורך הקו רשם גלים בכל מסגרת של הקלטת וידאו זמן לשגות, נקבל הערכה של קוטר neurite במהלך שחרורו של מתח. בלוח 3 ג, אנו מדווחים על סך השונות של חרוז מצורף בשחרור המתח, המחושב על בסיס העקבות נרשמו על ידי אינטרפרומטר (באיור 2b) אחרי הגבהה גבוהה סינון בתדר 10 הרץ חתוך. אנו יכולים לצפות שהשונות עולה עם קוטר neurite במהלך ההצטברות של חומר במעלה הזרם של אתר נגע. לאחר מכן, את השונות מתחילה ירידה (בt0 באיור 3 ג) כאשר הקרום הוא מתוח, וקוטר neurite יורד מדי. ירידת השונות מגיעה למישור (בT1 באיור 3 ג), כאשר שחרור המתח מפסיק. לאחר T1, התנועה הבראונית מתחילה לעלות בגללשל רגיעה קרום אולי בשל exocytosis 21 (ראה איור 3 ג).
באיור 4 א, הקופסה הלבנה מציינת את ההערכה של שטח מגע neurite האקסון בתמיכת התרבות. האקסון מחושב בין עמדת נקודת לייזר UV והמרכז של החללית הלכודה. איור 4 דיווחי עקבות המשרעת של כוח F שוחרר הכולל המתקבלים לאחר שפורסמו הכפלת עקבות התזוזה QPD להיסחף-המתוקנת (באיור 2b) על ידי ההתאמה מכוילת נוקשות מלכודת אופטיות (K x, y K, K z). אנו מחשבים את ההפרש בין כוח שנמדד בשלב T1 וt0 (ΔpN באיור 4), ולאחר מכן אנו מחלקים ידי האקסון, כדי להשיג את המתח משתחרר במונחים של pN / 2 מיקרומטר.
על ידי חזרה על אותו הפרוטוקול בתאי עצב שונים במדגם, אנו יכולים להתחילהפעלות של ניסויים בכמה תרבויות מטופלים עם גורמים כימיים או מצופים על מצעים שונים, ולבסוף להשוות את הערך הממוצע שהושג בתנאי הניסוי שונים. באיור 5, שמראים על שחרורו של מתח לאחר נגע axonal הוא לחה על ידי הידבקויות מוקד על פני המצע, ובכך לשחרר את מתח ערך גבוה יותר פירושו פחות האקסון דבק במצע. מכיוון שאנו לגרום חלקיים, ולא מלא, נגע של האקסון, חקרנו את התלות של שחרור המתח נמדד על סך האנרגיה המועברת, ועל שטח המגע בין neurite אתר נגע וחרוז לכוד. אנחנו ביקש להשמיד אלמנטי cytoskeletal יותר על ידי מתן מספר גבוה יותר של הבזקי אור, וכתוצאה מכך לגרום לשחרורו של מתח גבוה. אחרת, עם שטח מגע גדל neurite, שציפינו למדידת כמות נמוכה יותר של שחרור מתח. באיור 5, אנו מראים כי התלות בשני הפרמטרים שהוזכרו לעיל היאלא ברור. לכן, אנו מסיקים כי הנגע החלקי המושרה (עם האנרגיה הנמוכה מכוילת בעבר לכל דופק; ראה שלב פרוטוקול 4.5), קשור לממד של מקום אבלציה 8, שאינו משתנה בעת השימוש באותה מטרת מיקרוסקופ ואותה האנרגיה לכל דופק במדגם. יתר על כן, העובדה ששחרורו של מתח אינו מתואם לאזור המגע אין זה מפתיע כי זה ידוע היטב כי פרמטרים אלה אינם מייצגים את אומדן טוב להידבקות התא למצע, כהידבקויות מוקד לכבוש רק 1% מ משטח בסיס 22.
איור 1. ייצוג גרפי של שיווי משקל שלד התא שיבשו בליזר axotomy. תא שומרת על מצע על ידי הידבקויות מוקד. חיצים הכחולים specify כוחות המתיחה שנוצרו על ידי אלמנטי cytoskeletal (מצויינים על ידי קפיצים). חיצים כחולים מציינים את האור שנוצרו על ידי הכוחות מנטרלים את מצע התרבות הנוקשה. בתרחיש פשוט יותר, לפני שהנגע, כוחות cytoskeletal והמצע הם זיווג וequilibrated. לאחר נגע לייזר המושרה של neurite, את הקשרים בין כמה מעיינות והמצע הם שיבשו. לכן, המצע הוא כבר לא מנטרל את כוח המתיחה של אלמנט cytoskletal. חרוז לכודים, מחובר לממברנה, עוקב אחר הכיוון של כוחות cytoskeleton שפורסם.
איור 2. מעקב interferometric של (א) שדה מואר לכוד חרוז, שצורף לממברנה של האקסון של תא עצב בהיפוקמפוס בנגע מושרה לייזר. תמונות שנרכשו במהלך אבלציה של האקסון. לפני הנגע בלוח השמאלי. לאחר הפגיעה בפנל הימני. חרוז מצופה פולי-D-ליזין מחובר לממברנה (polystirene חרוז, O 4 מיקרומטר) והחזיק במלכודת אופטית. הספק ממוצע של לייזר אינפרא אדום במדגם הוא 14 mW. חץ לבן מצביע על האתר של נגע. בר הוא 5 מיקרומטר. (ב) עקבות נרשמו על ידי גב interferometry מישור מוקד של עמדת חרוז במלכודת האופטית. עקבות כחולות, ירוקות ואדום מייצגות את עמדת חרוז לאורך x, y, z וצירים, בהתאמה. קצב דגימה הוא 20 קילוהרץ. (ג) תזוזה של שריטה על תמיכת התרבות נמדדת על ידי מעקב וידאו לניטור נדידת הבמה. עקבות כחולות וירוקות הן עמדות X ו-Y שהושגו על ידי מעקב וידאו. קצב פריימים הוא 5.5 הרץ.
77fig3.jpg "/>
איור 3. ניתוח של קוטר האקסון במהלך שחרור המתח, ומתח הקרום של האקסון lesioned. (א) תמונה בשדה בהירה של האקסון lesioned, בפנל השמאלי. ניצב הקו הלבן לאקסון מציין את המיקום שבו רשם גלים מחושבים. בפנל הימני, רשם גלים של קוטר האקסון, במעלה הזרם של אתר נגע. כל שורה של רשם גלים מתאים ל0.18 שניות. (ב) סכום של עוצמות הפיקסלים של כל שורה של רשם גלים המייצגים את אומדן קוטר האקסון במהלך שחרור המתח. (ג) סה"כ שונות של התנועה הבראונית של חרוז מצורף האקסון (t0 וT1 מצביעים בהתאמה ההתחלה ואת הסוף של שחרור מתח באקסון לאחר נתיחה).
0477/50477fig4.jpg "/>
איור 4. כימות של המתח שוחרר לאחר axotomy. (א) תמונה בשדה בהירה של האקסון lesioned. הקופסה הלבנה מצביעה על האומדן של שטח המגע בין neurite אתר נגע ומרכז חרוז הלכוד. (ב) עקבות של המשרעת הכוללת של כוח נמדד לאחר axotomy (F טוט = √ (Fx 2 + 2 + פ.י. Fz 2)). Fx, פ.י., וFz חושבו על ידי חוק הוק (F = KX), שבו את עקבות התזוזה הן אלה המוצגים באיור 2. את stiffnesses, בשלושת הכיוונים מאונך, של המלכודת האופטית חושבו על ידי שיטת ספקטרום כוח (k x, = 7.9 מיקרומטר / PN, K z = 2.3 מיקרומטר y PN /). ΔpN מציין את כוח שוחרר נמדד בין רגעי הזמן t0 וT1.
איור 5. תלות של שחרור מתח שנמדד בכמות האנרגיה שמועברת למדגם, ועל שטח מגע neurite. נתונים מ -26 ניסויים שבוצעו על האקסונים של תאי עצב בhippocamapal עכבר 3 DIV. (א) עלילת פיזור של שחרור מתח לעומת שטח מגע neurite בין מקומות חרוז נגע ולכודים. (ב) עלילת פיזור של שחרור מתח לעומת סכום הכולל של אנרגיה מועברת לאזור מגע neurite המדגם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מדווחים בעבודה זו שיטה כמותית להשוואת הידבקות neurite למצע התרבות, על ידי ביצוע מדידת ספקטרוסקופיה כוח בו זמנית בנגע תא מושרה לייזר. שחרורו נמדד מתח קשור למידת ההדבקה של התא למצע: תאים עם מספר גבוה יותר של הידבקויות מוקד צריכים לשחרר פחות מתח. מדידת שחרור המתח במונחים של piconewtons מספקת כמות פיזית שבו כדי להעריך את הידבקות axonal לתמיכת התרבות בתנאים שונים 14 ניסויים.
מספר מעבדות משולבות מבתר לייזר עם מערכת פינצטה אופטית, אימוץ עיצובים אופטיים שונים 23. הבחירה שלנו הייתה התקנה עם נתיב אופטי קבוע ותנועת הבמה מיקרוסקופ. כדי להשיג זאת, אנו מציגים מאפנן אור מרחבי בנתיב קרן לייזר אינפרא אדום כדי להזיז את נקודת ההשמנה ביחס למצב לייזר UV. למרות galvanometrמראות IC לאפשר היגוי עמדת מיקוד לייזר מבלי להזיז את המדגם, הם יכולים להציג את הרעש מכאני במערכת המשפיעה על מדידות ספקטרוסקופיה כוח. יתר על כן, החלטנו לחזור ולמקם את מיקוד לייזר אינפרא אדום במדגם, שכן ניתוח תנועה הבראונית מאפשר כיול מחדש מהיר של הנוקשות אופטיות. הזזת מיקום נקודת לייזר UV על המדגם יכולה לייצר סטיות כדוריות המשפיעות על איכותו של מקום UV המוקד עצמו, שהנן זניחים רק להתקות קטנות של הקרן מהמיקום המרכזי שלו. לכן, שינוי של התכונות האופטיות של לייזר המבתר יכול לדרוש דה נובו כיול של כוח לייזר נמסר לעומת נזק לגוף.
על ידי מדידת ספקטרוסקופיה כוח, אנחנו יכולים לצפות כי שחרור המתח מורכב משלב מהיר של כמה שניות, ושלב איטי שיכולים להימשך כמה עשרות שניות. כפי שדווח בעבודה הקודמת של 14, לפעמים האיטיתשלב יכול להימשך כמה דקות. מהסיבה זו, הייתה עלינו לתקן את מדידת כוח על ידי מעקב וידאו שריטה על תמיכת התרבות. בעתיד, גישה טובה יותר תהיה לבטל להיסחף במה עם לולאת משוב, ש- מתקן אוטומטי את מיקום הבמה מיקרוסקופ וידאו או על ידי מעקב interferometric של חרוז מצורף מכסה הזכוכית. סוג זה של תצורה, כבר דווח בספרות, דורש קרן לייזר שנייה התמקדה בחרוז המצורף, ומבטיח ייצוב במה עם דיוק משנה ננומטר 24,25.
בעתיד, אנחנו רוצים ליישם את הפרוטוקול שפותח כדי להשוות את הידבקות axonal לתמיכת התרבות בשלבים שונים של בידול ושונים במצבים פתולוגיים שונים על מנת לספק assay כמותי לטיפול תרופתי. יתר על כן, באותו הפרוטוקול יכול להחיל על העיצוב של פיגומים מושתלים, כדי להשוות את ההידבקות העצבית לסוגים שונים של חומרים עם mech הברורanical או כימי מאפיינים 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אלברטו Guiggiani לפיתוח מערכת הבקרה בזמן אמת, אוולינה Chieregatti וHanako צושימה לדיוני תובנה, ג'אקומו Pruzzo ואלסנדרו פארודי לפיתוח אלקטרוניקה ותוכנה מותאמות אישית, וקלאודיה Chiabrera ומרינת נאני לייעוץ המקצועי שלהם וסיוע בהכנת תרבית תאים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | Hamamatsu | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop | ||
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
- Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
- Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).
- Stiess, M., Maghelli, N., et al. Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation. Science. 327, 704-707 (2010).
- Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap. Cytometry. 12, 505-510 (1991).
- Pinato, G., Raffaelli, T., D'Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells. J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).
- Kress, H., Park, J. G., et al. Cell stimulation with optically manipulated microsources. Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).
- Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
- Difato, F., Dal, M. M., et al. Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks. Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- O'Toole, M., Miller, K. E. The role of stretching in slow axonal transport. Biophys. J. 100, 351-360 (2011).
- O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).
- Difato, F., Tsushima, H., et al. The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF. Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).
- Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks. International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).
- Guiggiani, A., Torre, B., et al. Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers. Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).
- Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. 3rd Real Time Linux Workshop. , (2011).
- Neuman, K. C., Block, S. M.
- Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair. Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).
- Kress, H., Stelzer, E. H., et al. Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).
- Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope. Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).
- Carter, A. R., King, G. M., et al. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review. Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).
