Summary
Här beskriver vi en metod för att analysera förändringar i initieringen av mRNA-translation av eukaryota celler som svar på stress förhållanden. Denna metod är baserad på den hastighet separation på sackarosgradienter av översätta ribosomer från icke-översätta ribosomer.
Abstract
Exakt reglering av mRNA-translation är grundläggande för eukaryot cell homeostas, särskilt som svar på fysiologisk och patologisk stress. Förändringar av detta program kan leda till tillväxt av skadade celler, ett kännetecken för cancerutveckling, eller till för tidig celldöd såsom framgår av neurodegenerativa sjukdomar. Mycket av vad som är känt om den molekylära grunden för translationell kontroll erhölls från polysom analys med hjälp av en densitetsgradient fraktioneringssystemet. Denna teknik bygger på ultracentrifugering av cytoplasmaextrakt på en linjär sackarosgradient. När spinn är klar, tillåter systemet fraktionering och kvantifiering av centrifugezoner som motsvarar olika översätta ribosomer populationer, vilket således resulterar i en polysom profil. Förändringar i polysom profilen indikerar förändringar eller defekter i translationsinitiering som inträffar som svar på olika typer av stress. Denna teknik gör det också möjligt att bedöma: ee rollen av specifika proteiner på translationsinitiering, och för att mäta translationell aktivitet av specifika mRNA. Här beskriver vi våra protokoll för att utföra polysom profiler för att bedöma translationsinitiering av eukaryota celler och vävnader i enlighet med antingen normala eller spänningstillväxtförhållanden.
Introduction
Eukaryota celler möter ständigt en rad skadliga fysiologiska och miljömässiga stressförhållanden som kräver en snabb adaptiv cellsvar. Cell stress innebär en exakt balans mellan anti-överlevnad och pro-överlevnad verkande faktorer. Störa denna balans kan få oåterkalleliga konsekvenser som leder utvecklingen av mänskliga sjukdomar som cancer och neurodegenerativa sjukdomar. Under det första steget av stress, celler aktiverar pro-överlevnad vägar som innebär samordnad kontroll av förändringar i genuttryck i nivå med mRNA-translation.
mRNA-translation i eukaryoter är en komplex cellulär process som involverar samordnade interaktioner mellan översättnings initieringsfaktorer (EIFS), specifika RNA-bindande proteiner (RBDS) och RNA-molekyler 1. mRNA translation är indelad i tre olika faser: initiering, töjning, och uppsägning. Även om alla tre faser är föremål för reglesyns mekanismer, translationella kontrollmekanismer riktar främst inledande fasen av översättning, som alltså utgör den hastighetsbegränsande steget av proteinsyntesen 2.
Translation initiation är en höggradigt ordnad process som börjar med bildandet av den eIF2a.GTP.Met-tRNA-I Met temära komplexet och dess efterföljande bindning till 40S-ribosom-subenheten, vilket leder till bildandet av pre-initiering komplex. Nästa steg är att rekryteringen av preinitiation komplexet till mRNA, som innebär att aktiviteten av translationsinitierings faktorer såsom eIF4F och eIF3. Den 48S preinitiation komplexa sätt bildade genomgår specifika konformationsförändringar som gör att denna maskin för att börja skanna 5'-oöversatta regionen av mRNA tills den känner igen initieringskodonet augusti De flesta av de översättnings initieringsfaktorer frigörs sedan och 60S-subenheter rekryteras för att bilda en 80S ribosomkomplexet kompetent för översättning, ent vilken punkt proteinsyntesen startar (figur 1). Mer än en 80S monosome kan översätta samma mRNA vid en tidpunkt som producerar så kallade polysomer (eller polyribosomer). Tätheten av polysomer på en mRNA speglar initiering, töjning och terminering, och därmed är ett mått på översättbarhet av en viss utskrift. Dock är polysom profil främst för att bedöma förändringar i mRNA translation vid initiering steget. Här har vi använt en proteasomhämmaren som translationsinitiering hämmare. Behandling av cancerceller med detta läkemedel inducerar en stressreaktion som kännetecknas av aktivering av stresskinas namnges HRI som fosforylerar translationsinitiering faktor eIF2a 3. Fosforylering av eIF2a är en av de viktigaste händelserna som leder till hämningen av translationsinitiering i däggdjursceller 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet följer de riktlinjer godkänd av Lavals etikprövningsnämnden.
1. Beredning av cellkulturer och Brain Manipulation
- Däggdjurs och Drosophila-celler
- Väx HeLa cervical cancerceller och Schneider Drosophila embryonala celler som rekommenderas av American Type Culture Collection. Arbeta med celler vid en låg passage.
- Plate celler i syfte att uppnå 80% sammanflytning på dagen för experimentet. För bästa resultat, använd ~ 12 x 10 6 celler för varje experimentell skick. Innan extrakt för polysom analys, stimulerar översättning genom att lägga färskt komplett medium i minst 90 min.
- Brain isolering: Isolera hjärnor från möss i åldern 9 och 16 dagar efter födseln. Eutanasi innebär CO2 inandning efter anestesi och halsdislokation. Efter offer, isolera hela hjärnan och antingen plats it vid -80 ° C eller direkt överföra den i kallt PBS 1X för omedelbar användning.
2. Beredning av densitetsgradient fraktioneringssystemet
- Tvätta rörsystemet med 0,1% SDS under 5 min.
- Tvätta rörsystemet med 70% etanol under 5 min, därefter med RNaseZAP lösning för 5 min före tvättning med DEPC-vatten.
- Pump luft för att torka rörsystemet i anordningen.
3. Beredning av sackarosgradienter
- Gör 15% och 55% sukros-lösningar i 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 1,25 mM MgCl2, 150 mM NaCl och 1 mM DTT.
- Generera den linjära 15-55% sackaros lutning med hjälp av en Isco modell 160 lutning förra, som beskrivs i tillverkarens instruktioner. Det är dock viktigt att styra väl TRIS peristaltiska pumphastigheten för att undvika skapandet av bubblor eller turbulens i lutningar. Håll gradienterna vid 4 ° C fram till användning.
- Under den tid då gradienten kokare program körs kyla ultracentrifug till 4 ° C.
4. Beredning för cell-och mus Brain Extrakt
- Framställning av cellextrakt
- Placera skylt (ar) på is och tvätta cellerna 3x med kall PBS 1X.
- Skörda celler (~ 12 x 10 6) i 1 ml lyseringsbuffert (20 mM Tris-HCl vid pH 7,4, 1,25 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1% Nonidet P40, 5 U / ml RNas-inhibitor, kompletterat med komplett mini EDTA-fri proteashämmare cocktail tabletter), överföra dem till ett Eppendorf-rör och blanda väl genom att passera dem 15x genom en 1 ml U100 insulinspruta 28 G 1/2. Låt cellysatet vila på is under 15 min.
- Sätt några droppar cellysat på en bild för att utvärdera cellulär lys genom att observera på ett faskontrastmikroskop med hjälp av en 10X objektiv. Endast kärnor ska vara synliga och inga cellmembran skall synas intygar för cell-lys. Som en kontroll, observeraolyserade celler.
- Clarify cellysatet genom centrifugering vid 11000 x g under 20 min vid 4 ° C och hålla den lösliga lysatet innehållande polyribosomer.
- Beredning av Mouse Brain Extrakt
- Homogenisera hela isolerade hjärnan (~ 500 mg) med 10 slag i en iskall Dounce-homogenisator med 2 ml av lyseringsbuffert och klargöra homogenatet genom centrifugering vid 11000 x g under 15 min vid 4 ° C.
- Fyll den resulterande supernatanten på en kudde av 50% sukros och fortsätt med sedimentering under 2 timmar vid 200000 x g med användning av en ultracentrifug rötor TH-641 vid 4 ° C.
- Resuspendera genomskinlig pellet innehållande de polyribosomer i 1 ml lyseringsbuffert och blanda väl genom att pipettera upp och ned. Låt upphängnings vila på isen i 30 minuter innan du lägger på lutningar.
5. Laddar extrakten på sackarosgradienter och Ultracentrifugering
- Mät koncentrationRNA som är närvarande i det cytoplasmatiska extraktet med användning av en spektrofotometer. Noggrant och långsamt ladda ~ 20 OD 260 enheter av extraktet på 15% till 55% sackarosgradient. Se till att det finns 2-3 mm av tillgängligt utrymme på ytan av röret för att undvika överfyllda rören under centrifugering.
- Centrifugera gradienter med användning av en ultra-centrifug under 2 tim 30 min vid 230000 x g med användning av en ultracentrifug rötor TH-641 vid 4 ° C. När centrifugeringen avslutas, ta bort rören och placera dem på is noga att inte störa gradienter.
6. Fraktionering av cytoplasmaextrakt för polysomer Profiling
- Placera sackarosgradienter på Automated Density Fraktione System och fortsätt med automatiserad fraktionering och uppsamling av fraktioner (0,5 ml vardera), som beskrivs av tillverkaren.
- Samla varje fraktion (~ 500 | al) i individuella Eppendorf-rör med en kontinuerlig övervakning av absorbansen vid 254 nm. I parallel övertoningsfraktione drift kommer polyribosomal profilen redigering på sjökortet papper. Alternativt kan du använda en datainsamlingsenhet ansluten till kortskrivaren att ha en elektronisk förvärv av polysom profilen.
- Vid slutet av varje körning, överför uppsamlade eppendorfs på torris. Vid denna tid, antingen lagrar uppsamlas fraktioner vid -80 ° C eller direkt utfällning av protein-RNA-komplex som följer.
7. Protein Extraction och analys
- För varje insamlad fraktion av sackarosgradient, tillsätt 2 volymer av 100% kall etanol och låt RNA-proteinkomplex falla ut vid -20 ° C över natten.
- Centrifugera varje RNA-protein fällningen vid 11.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C, tvättas därefter med 70% etanol. Torr och återsuspendera fällningen i SDS-PAGE-provbuffert innan man går vidare med Western blöt med användning av specifika antikroppar (se figur 2).
8. RNA-extraktion och AANALYS
- Fällning RNA-proteinkomplex som i avsnitt 7.1. Resuspendera varje RNA-protein-utfällningen i lysbuffert innehållande 0,1% SDS. Digerera proteinkomponenten av fällningen med 2 mg / ml proteinas K under 30 min i ett 55 ° C vattenbad.
- Extrahera RNA-komponenter av fällning genom tillsats av en volym av "fenol: kloroform", 2 volymer av kloroform och 0,1 volym av 2 M NaOAc pH 4 och centrifugering vid 10000 x g vid 4 ° C under 20 min. Utfällning RNA från den resulterande vattenfasen i varje prov över natten vid -20 ° C genom tillsats av en volym isopropanol och 0,2 ug / ul av glykogen. Spin fällningen under 1 timme vid 10.000 x g vid 4 ° C. Tvätta RNA-pelleten med 70% kall etanol.
- Resuspendera RNA pelleten i en liten volym av RNAs-fritt vatten. Bedöm mängden och kvalitet av RNA med användning av spektrofotometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som tidigare nämnts tillåter polysom profil analys av förändringar av translationsinitiering under stressförhållanden. Figur 1 är en förenklad vy av translationsinitiering vilket såsom beskrivits tidigare är en flerstegsprocess som involverar en ordnad sammansättning av komplexen translation initiation. Under normala tillväxtbetingelser, är komplexen translationsinitierings omvandlas till polyribosomer vars detektering genom polysom profil intyga för en aktiv translationsinitiering (Figur 2; Obehandlad). Under stressförhållanden emellertid translationsinitiering blockerad vilket resulterar i ackumulering av 80S monosomes och en minskning av polysom toppar (figur 2; proteasom-hämmare).
Figur 1. A s implified vy av translationsinitiering. Translationsinitiering involverar flera steg: 1) Bildandet av eIF2a.GTP.Met-tRNA jag träffade ternära komplex, 2) en sammanslutning av den ternära komplex med 40S ribosomer bildar den 43S preinitiation komplexa, 3) en sammanslutning av 43S komplex med mRNA formning av 48S preinitiation komplex, 4) avsökning av den 5'-otranslaterade regionen av mRNA genom 48S ribosomer tills den når och identifierar den inledande augusti kodonet, och 5) rekrytering av den stora ribosomala subenheten 60S till 48S bildar 80S komplexet vid vilken punkt polypeptider syntes börjar. Varje steg av translationsinitiering innebär aktiviteten av flera översättnings initieringsfaktorer. Klicka här för att visa en större bild .
upload/51164/51164fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51164/51164fig2.jpg "width =" 500px "/>
. Figur 2 polysomer profiler och analys av polysomer associerade proteiner med Western blöt i HeLa-celler (A - B). Cytoplasmatiska extrakt framställdes från HeLa-celler som odlats antingen i normala förhållanden (A) eller efter behandling med det proteasome inhibitor för 4 h (B ) och centrifugeras på en 15-55% v / v linjär sackarosgradient. Polysomer profiler anges i den övre panelen. Positionerna för 40S ribosomer, 60S ribosomer, 80S monosomes och polysomer anges i varje profil. Fraktioner från den övre (15%) till botten (55%) av gradienten visas från vänster till höger. Fraktioner uppsamlades och analyserades genom western blöt (bottenpanelema) med antikroppar mot den stora ribosomala L28-proteinet såväl som med den polysom-associerat protein FMRP att tjäna som kontroller för polysom integritet 5,6. Observera att Treatment med proteasomhämmaren minskar polysomer toppar med en samtidig ökning av 80S monosomes indikerar en hämning av translationsinitiering. Typiska profiler som erhållits från Schneider Drosophila celler eller möss hjärnan har beskrivits på annan plats 7-10. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den polysom profilanalys på sackarosgradienter möjliggör mätning av translationsinitiering genom att analysera tätheten av polysomer isolerade från celler eller vävnader 9,11-14. Denna teknik är det bästa (om inte det unika) metod för att mäta translationsinitiering in vivo. Det används för att övervaka translationell status odla celler under cellcykeln 15, och för att bedöma effekterna av olika typer av stress, inklusive virusinfektioner, hypoxi 13,16, strålning 17 och kemiska droger 18 används i terapi, på translationsinitiering. Men medan denna teknik fungerar bra för att bedöma translationsinitiering av cellkulturer och specifika vävnader såsom hjärna och lever, återstår det att fastställas om det kan användas för att jämföra translationsinitiering av normala kontra sjuka vävnader och tumörer.
Förändringar i polysom profiler kan också förekomma under förhållanden som förändrar översättnings töjningention eller uppsägning. I dessa fall kommer inhibition av töjningsegenskaper hastigheter av translation leder till en ökning av polysomer toppar medan en hämning av upphörande bör resultera i större polysomer i förhållande till kontrollen. Däremot hämmare av translationsinitiering förhindrar reformation av polysomer eftersom bildandet av translationsinitierings komplex aktiv blockeras. Detta återspeglas i polysomer profiler genom en minskning av polysomer toppar med en samtidig ökning av 80S monosomes. Eftersom översättnings hämmare stall komplex translation initiation, förväntas det att både 40S och 60S toppar också kommer att öka. Men väldigt ofta en ökning av endast 80S monosomes observeras vid hämning av translationsinitiering. Anledningen till varför en ökning av de andra ribosomala komplexen inte observeras är för närvarande okänt. En möjlig förklaring kan vara att slumpartad associering mellan avstannade ribosomala komplex kan förekomma under extraktion som leder till den observerade ackumulation av endast 80S monosomes.
Förutom analysen av translationsinitiering kan polysom profil teknik hjälper till att bekräfta identiteten hos translationsinitierings faktorer (såsom eIF4E, eIF4A och eIF4G) och att identifiera nya tillsynsmyndigheter översättning. Som översättnings initieringsfaktorer frigörs från ribosomer i sista translationsinitiering steg bör de inte upptäckas över översätta ribosomer fraktioner. Föreningen av proteiner såsom FMRP 14, SMN 19,20, TDRD3 21 med både polysomer och icke-polysomerna fraktioner visar att reglerande roll dessa proteiner i översättning inte är begränsad till den inledande steget. Övervakning av sammanslutning av proteiner med polysomer utgör också ett kraftfullt medel för att bedöma hur stressförhållanden kan påverka translationell aktiviteten av specifika proteiner. Det är dock inte tillräckligt för att dra slutsatsen en translationell rol föreningen av specifika proteiner med polysomer av sig själve, som sedan måste bekräftas genom funktionella studier. Slutligen tillåter polysom profiltekniken bestämning av translationell aktiviteten av specifika mRNA under olika förhållanden, och för undersökning av specifika mekanismer som reglerar översättnings t.ex. miRNA förmedlad translationell förtryck 22. Den allmänna användningen av polysom analyser kan utökas ytterligare med hjälp av en mängd olika tillämpningar i senare led, inklusive genomet hela microarrayanalys och på senare tid transkriptom skala ribosomen profilering 23-26 möjliggör robust förutsägelse av proteinuttryck och framför allt ge ett nytt kraftfullt experimentellt verktyg för analys av translationell kontroll 23-27.
Som med alla metodik, försiktighetsåtgärder måste vidtas när de utför polysom profilering. I detta avseende bör flera parametrar såsom cellpassage, cell-lys, mängd cellextrakt som ska lastas på lutning, och RNA integritet vara väl controlled. Optimering av ultracentrifugeringsvillkor krävs också för att få den bästa separationen av ribosomal befolkning genom sackarosgradienter. Komponenter som utgör övertoningar och lyseringsbuffert såsom sackaros och rengöringsmedel kan ge absorbans vid 254 nm våglängd. Det är således viktigt att inkludera en styr gradient innehållande enbart lyseringsbuffert. Slutligen bör de lutningar själva hanteras med försiktighet eftersom minimal störning av lutningar kan orsaka stora effekter på polysomer profiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
PA är en mottagare av ett stipendium "Pierre Durand" från Medicinska fakulteten i Laval University. Detta arbete stöddes av naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (MOP-CG095386) till RM Den polysom fraktioneringsförvärvades genom en kanadensisk stiftelse för bidrags innovation (MOP-GF091050) till RMR M har en ny CIHR utredare lön utmärkelse.
Vi är tacksamma till Dr. E. Khandjian, I. Gallouzi, S. Di-Marco och A. Cammas för goda råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | |
| Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | |
| Culture medium and Supplements | |||
| Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | |
| DMEM | Life technologies | 11995-073 | |
| FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | |
| Penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | |
| Sucrose solutions | |||
| D-sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientist | B3925 | |
| Lysis buffer | |||
| Tris HCl | Fisher Scientist | BP153-500 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | |
| NaCl | Tekniscience | 3624-05 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | |
| Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | |
| SDS | Tekniscience | 4095-02 | |
| RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | |
| Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | |
| RNA Extraction | |||
| Proteinase K | Life technologies | AM2542 | |
| Phenol:chloroform | Fisher Scientist | BP1754I-400 | |
| Chloroform | Fisher Scientist | C298-500 | |
| Glycogen | Life technologies | 10814-010 | |
| Isopropanol | Acros organics | 327270010 | |
| Antibodies | |||
| anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | ||
References
- Gebauer, F., Hentze, M. W.
- Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).
- Fournier, M. -J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell International. 10 (12), (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).
- Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
- Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs. Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).
- Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms. RNA. 15 (10), New York, N.Y. 1814-1821 (2009).
- Gareau, C., Houssin, E., et al. Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
- Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
- Khandjian, E. W., Huot, M. -E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).
- Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. Translational control of gene expression in the human brain. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).
- Stephens, S. B., Nicchitta, C. V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum. Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).
- Koritzinsky, M., Wouters, B. G. Hypoxia and regulation of messenger RNA translation. Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).
- Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes. Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).
- Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division. Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).
- Thomas, J. D., Johannes, G. J. Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia. RNA. 13, 1116-1131 (2007).
- Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components. Cancer Research. 68 (10), 3819-3826 (2008).
- Fournier, M. -J., Coudert, L., et al. Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation. Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).
- Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator. Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).
- Béchade, C., Rostaing, P., et al. Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport. The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).
- Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules. Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).
- Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).
- Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association. BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).
- Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), New York, N.Y. 414-421 (2007).
- Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Morris, D. R. Ribosomal footprints on a transcriptome landscape. Genome Biology. 10 (4), (2009).
