成像大鼠原代海马神经元树突棘使用结构照明显微镜
Summary
本文介绍了使用结构照明显微镜（SIM卡） 在体外海马神经元的工作协议，以形象的树突棘。使用SIM卡超高分辨率显微镜提供的图像分辨率显著超越在所有三个空间维度的光的衍射极限，允许单个树突棘与改进的细节的影像。
Abstract
树突棘是新兴突起从一个神经元的树突和代表在脑兴奋性输入端的初级突触后指标。技术进步已经确定这些结构在神经元连通性和突触可塑性的关键要素。利用光学显微镜棘形态的定量分析仍然是由于光的折射内在限制相关的技术限制，一个重要的问题。树突棘可以很容易地确定共聚焦激光扫描荧光显微镜。然而，测量在刺的形状和大小的细微变化是困难的，因为比长度其他脊柱的尺寸通常比固定为200nm的光镜的理论分辨率极限传统的光学分辨率小。
几个最近开发的超分辨率技术已被用来对图像蜂窝结构比200纳米，包括树突棘小。 Ŧ淡褐色技术是基于经典的远场操作，因此允许使用现有的样品制备方法及图像以外的试样的表面上。这里描述的是工作协议，超分辨率结构照明显微镜（SIM）适用于原代海马神经元培养树突棘的影像。 SIM卡可能的应用重叠与激光共聚焦显微镜。然而，这两种技术提出不同的适用性。 SIM卡可提供更高的有效横向分辨率，而共焦显微镜中，由于一个物理针孔的使用量，实现了分辨率的改善以除去离焦光的费用。在这个协议中，原代神经元是使用标准协议，转染的DNA的质粒编码的荧光蛋白质和可使用SIM成像的玻璃盖玻片上培养的。这里所描述的整个协议需要大约2周，因为树突棘是体外后16-17天，当成像树突发育是最优的。协议完成后，树突棘可以在3D系列从使用专门的软件，SIM卡图像堆栈的重建。
Introduction
一个树突棘是神经元膜的小突起。这种结构的特点是专业，如从单一的突触接收输入并代表两个神经元之间的物理接触面积。功能最成熟的树突棘包括一个球状尖，称为头和颈细，头部连接到树突状轴。然而，刺不是静态的，积极移动，不断改变自己的形态，甚至在成人大脑2。在规定时间内有2周的时间，从胚胎后期或出生后早期的时间得出大鼠原代海马神经元培养开发复杂的树突状乔木与众多的膜突起，从早期的filipodia演变为棘状结构3。在此基础上动态行为等特点，树突棘被认为是提供了一个解剖基板的内存存储和突触传递4,5。
鉴于日Ë关键作用的树突棘的大小和形状都在突触功能，它准确地测量它们的尺寸是很重要的。刺从约200到2,000纳米，长度各不相同，可以通过共焦激光扫描荧光显微镜很容易识别。然而，长度比其他脊椎尺寸通常低于传统的光学系统的分辨率，理论上固定衍射约200纳米的6。这些解决权力是不够的成像更精细的细节，如脊柱的脖子和头的宽度。大量的工作一直致力于解决这个问题，许多相对较新的超高分辨率显微技术提供了实质性的进展。特别是，能够实现超越经典极限分辨率，不通过在一个宽视场，非共聚焦显微镜7-10采用横向结构照明显微镜（SIM）丢弃任何发射光。与非线理组合使用这种技术Ř显微技术，它在理论上是可能通过一个无限因子11，以提高光学显微镜的横向分辨率。然而，在大多数实验的情况下，SIM允许将超过由两个1的因子的分辨率极限。如受激发射损耗（STED）显微镜12和光激活定位显微镜（PALM）12其他超分辨率光学显微技术已被应用到树突棘的影像。定位为基础的方法，如PALM需要非常大的数字原始图像，实现超分辨率的，因此在有限的速度。另一方面，受激发射损耗可以达到高的成像速度，但是在相对 低的光子数和视场小，这可能不是SIM卡13的情况。
在本文中，目的是从大鼠原代海马神经元在体外培养提供了一个工作协议到图像树突棘</EM>使用SIM卡。该协议由两个可区分的阶段：一个初始组成的建立，发展，转染大鼠原代海马神经元培养的免疫组化和专用采样成像的后期阶段。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这篇文章中的工作协议从大鼠原代海马神经元使用SIM卡在体外培养的图像树突棘描述。在原代海马神经元培养方法是通过Kaech和庄家18中描述的原始方法的改编。的主要差别是使用Neurobasal/B27培养基中，从而消除了星形胶质细胞培养物进料器的要求，并且除了在第3天的有丝分裂抑制剂FUDR能促进神经元的存活，同时抑制神经胶质增生的，如所描述由Brewer 等人 19。
<…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作的经费由荷兰科学研究组织（NWO）以中央公积金的VIDI授权号H64.09.016。 CPF是感激医生Silvina A. Fratantoni她的批评意见，并在最后的手稿更正。 GMRDL / EMMM公司受荷兰技术基金会STW（项目12151和11350），这是苏国的一部分，这部分是由经济事务部资助支持。我们感谢尼康仪器Europe BV公司的凯瑟琳·基茨和彼得·德兰特的援助和支持。被授予荷兰科学研究组织（补助金820.02.006）支持HX是支持艺术和科学的荷兰皇家科学院（补助11CDP10）和WT。
Materials
| Fine forceps | |||
| Big forceps | |||
| Fine scissor | |||
| Big scissor | |||
| Blunt spatula | |||
| Dissecting microscope with illumination | |||
| Light microscope | |||
| 37 °C water bath | |||
| Laminar flow cell culture hood | |||
| High-temperature dry-oven | |||
| Bunsen burner | |||
| Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C) | |||
| Microcentrifuge | |||
| Orbital shaker | |||
| Nikon structured illumination microscope setup consisting of: | |||
| Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System | |||
| Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49) | |||
| 4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength) | |||
| SIM Illuminator | |||
| Nikon Stage Controller | |||
| MCL Nano-Drive piezo controller | |||
| Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp | |||
| SIM Microscope Enclosure temperature control | |||
| Andor EM-CCD Camera iXon DU897 | |||
| PC with Microsoft Windows 7 Home Edition | |||
| Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package | |||
| Nikon type A immersion oil |
Riferimenti
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Curr Opin Neurobiol. 19, 146-153 (2009).
- Dailey, M. E., Smith, S. J. The dynamics of dendritic structure in developing hippocampal slices. J Neurosci. 16, 2983-2994 (1996).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
- Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61, 85-100 (2009).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9, 413-418 .
- Gustafsson, M. G., Agard, D. A., Sedat, J. W. I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution. J Microsc. 195, 10-16 (1999).
- Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. Proc. SPIE 3568 Optical Biopsies and Microscopic Techniques III. , 185-196 (1999).
- Karadaglić, D., Wilson, T. Image formation in structured illumination wide-field fluorescence microscopy. Micron. 39, 808-818 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320, 1332-1336 (2008).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13081-13086 (2005).
- Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 18982-18987 (2008).
- Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat Methods. 6, 339-342 (2009).
- James, C. D., et al. Aligned microcontact printing of micrometer-scale poly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planar microelectrode arrays. IEEE Trans Biomed Eng. 47, 17-21 (2000).
- Dumitriu, D., Rodriguez, A., Morrison, J. H. High-throughput, detailed, cell-specific neuroanatomy of dendritic spines using microinjection and confocal microscopy. Nat Protoc. 6, 1391-1411 (2011).
- Fitzsimons, C. P., et al. Knockdown of the glucocorticoid receptor alters functional integration of newborn neurons in the adult hippocampus and impairs fear-motivated behavior. Mol Psychiatry. , (2012).
- van Hooijdonk, L. W., et al. Lentivirus-mediated transgene delivery to the hippocampus reveals sub-field specific differences in expression. BMC Neurosci. , (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Izeddin, I., et al. Super-resolution dynamic imaging of dendritic spines using a low-affinity photoconvertible actin probe. PLoS ONE. 6, (2011).
