구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징
Summary
이 문서는 구조적 조명 현미경 (SIM)을 사용하여 체외에서 해마 신경 세포에서 이미지 돌기 쪽을 작동 프로토콜을 설명합니다. SIM을 사용하여 초 고해상도 현미경 개선 된 세부 사항과 함께 개별 돌기 쪽의 영상을 허용, 크게 세 가지 차원 공간에서 빛의 회절 한계를 넘어 이미지 해상도를 제공합니다.
Abstract
돌기 쪽은 신경 세포의 수상 돌기에서 나오는 돌출부이며, 뇌의 흥분성 입력의 기본 시냅스 대상을 나타냅니다. 기술의 발전은 신경 세포의 연결 및 시냅스 가소성의 핵심 요소로 이러한 구조를 발견했습니다. 광학 현미경을 사용하여 척추의 형태의 정량 분석에 의한 빛의 굴절 고유 제한과 관련된 기술적 인 한계에 대한 근본적인 문제가 남아있다. 돌기 쪽이 용이하게 공 초점 레이저 주사 형광 현미경에 의해 식별 될 수있다. 길이 아닌 다른 척추 치수는 일반적으로 200 ㎚의 광학 현미경의 이론적 인 해상도 한계에 의해 고정 된 기존의 광학 해상도보다 작은 있기 때문에, 척추의 모양과 크기에 미묘한 변화를 측정하는 것은 어렵다.
몇 가지 최근에 개발 된 슈퍼 해상도 기술이 돌기 쪽을 포함하여 200 나노 미터보다 작은 이미지 세포 구조에 사용되어왔다. 티HESE 기술은 고전적인 원방 조작에 기초하기 때문에 시료의 표면을 넘어 기존의 샘플 준비 방법과 이미지를 사용할 수있게됩니다. 여기에 설명 된 기본 해마 신경 세포의 문화에 돌기 쪽의 영상을 초 고해상도 구조 조명 현미경 (SIM)을 적용하는 작업 프로토콜입니다. SIM의 가능한 응용 프로그램은 공 초점 현미경의 사람들과 겹칩니다. 그러나,이 기술은 다양한 적용 가능성을 제시한다. 공 초점 현미경으로 인해 실제 구멍의 사용에 초점 빛을 밖으로 제거의 비용으로 해상도 향상을 달성하면서 SIM은, 높은 효과적인 측면 해상도를 제공합니다. 이 프로토콜에서 기본 뉴런은 DNA 플라스미드는 형광 단백질을 인코딩하고 SIM을 사용하여 몇 군데로 형질 표준 프로토콜을 사용하여 유리 커버 슬립에 배양. 돌기 쪽이 체외에서 16-17일 후, 때 이미지가 있기 때문에 여기에 설명 된 전체 프로토콜은, 약 2 주 소요수지상 개발이 최적이다. 프로토콜을 완료 한 후, 돌기 쪽이 전문 소프트웨어를 사용하여 SIM 이미지 스택의 시리즈에서 3D로 재구성 할 수있다.
Introduction
수지상 척추 신경 막의 작은 돌기이다. 이 특징적인 구조는 일반적으로 단일 시냅스로부터 입력을 수신하도록 전문이 뉴런 사이의 물리적 접촉 면적을 나타내고있다. 대부분의 기능적 성숙 돌기 쪽은 구형 팁,라고 머리, 그리고 돌기 축에 머리를 연결하는 얇은 목으로 구성되어 있습니다. 그러나 등뼈가 정적되지 않고 적극적으로 이동하고 심지어 성인의 뇌 2에 지속적으로 형태를 변경합니다. 시간이 2 주 기간 내에서 후반 배아 또는 출생 초기 시간에서 파생 된 쥐 차 해마 신경 세포 배양은 척추와 같은 구조 3 초 filipodia 진화 수많은 막 돌기 복잡한 돌기 아버을 개발한다. 이러한 동적 동작과 다른 특성에 기초하여, 돌기 쪽은 메모리 저장 및 시냅스 전달의 4,5위한 해부 기판을 제공하는 것으로 생각된다.
일을 감안할 때돌기 척추의 크기와 모양이 시냅스 기능에, 정확하게 자신의 치수를 측정하는 것이 중요하다 것을 전자 중요한 역할. 등뼈의 길이는 약 200 내지 2000 나노 미터에서 변화 좀처럼 공 초점 레이저 주사 형광 현미경에 의해 식별 될 수있다. 그러나 길이보다 다른 척추의 크기는 일반적으로 이론적으로 200 나노 미터 6 주위 회절에 의해 고정 된 종래의 광 시스템의 해상도, 아래에. 이러한 해결 능력은 척추의 목 및 머리의 폭과 미세한 세부 사항을, 이미징에 충분하다. 많은 일이 문제를 해결하기 위해 전념하고있다 많은 비교적 새로운 슈퍼 해상도 현미경 기술은 상당한 진전을 제공하고 있습니다. 특히, 광 시야, 비 촛점 현미경 7-10에서 측방 구조화 조명 현미경 (SIM)을 사용하여 임의의 발광색을 폐기하지 않고 고전 넘어선 해상도를 달성 할 수있다. 비 리네아와 함께이 기술을 사용R 현미경 기법, 그것은 제한 요소 (11)에 의해 광학 현미경의 측 방향 해상도를 개선하기 위해 이론적으로 가능하다. 그러나, 대부분의 실험 상황에서, SIM은이 하나의 요인에 의한 해상도 한계를 넘어 설 수있다. 이러한 자극 방출 고갈 (STED) 현미경 (12)와 사진 활성화 현지화 현미경 (PALM) 12와 같은 다른 슈퍼 해상도 광학 현미경 기술은 돌기 쪽의 영상에 적용되었습니다. 같은 PALM 등 현지화 기반의 방법은 최고 해상도를 달성하기 위해 RAW 이미지의 매우 큰 숫자를 필요로하기 때문에 속도가 제한됩니다. 한편, STED 높은 촬상 속도를 달성 할 수있는 비교적 낮은 광자 카운트 및 SIM (13)에 대한 경우가 아닐 수도 보이는 작은 필드에서 비록.
이 문서의 목적은 체외에서 배양 한 쥐의 기본 해마 신경 세포에서 이미지 돌기 쪽을 작동하는 프로토콜을 제공하는 것입니다 </EM> SIM을 사용하여. 설립, 개발, 형질 전환 쥐의 기본 해마 신경 세포 배양의 면역 조직 화학 염색과 영상을 샘플링하기 위해 최선을 다하고 늦은 단계로 구성된 최초의 하나 :이 프로토콜은 서로 구분되는 두 단계로 구성됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서는 SIM을 사용하여 체외에서 배양 된 쥐의 기본 해마 신경 세포에서 이미지 돌기 쪽을 작동 프로토콜을 설명한다. 차 해마 신경 세포 배양법 Kaech와 뱅커 (18)에 의해 설명 된 방법 일본어의 적응이다. 브루 등 19에 의해 설명 된 주된 차이점은, Neurobasal/B27 배양 astroglial 피더 문화의 요구를 제거 가능 매체, 및 아교 세포의 증식을 억제하면서 신경의 생존을 촉…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 CPF에 과학 연구에 대한 네덜란드기구 (NWO)의 VIDI 인증 번호의 H64.09.016에 의해 재정되었다. CPF는 그녀의 중요한 의견과 최종 원고에 대한 수정 박사 Silvina A. Fratantoni에 감사합니다. GMRDL / 네 ..는 네덜란드의 기술 재단 NWO의 일부입니다 STW (프로젝트 12151 및 11350), 어느 부분적 경제부에 의해 자금 지원에 의해 지원된다. 우리는 도움과 지원을 위해 니콘 인스트루먼트의 유럽 BV의 캐서린 키츠 피터 Drent 감사합니다. HX 보조금 과학 연구에 대한 네덜란드기구 (부여 820.02.006)에 의해 지원되었다 네덜란드 왕립 예술 과학 아카데미 (부여 11CDP10) 및 WT에 의해 지원되었다.
Materials
| Fine forceps | |||
| Big forceps | |||
| Fine scissor | |||
| Big scissor | |||
| Blunt spatula | |||
| Dissecting microscope with illumination | |||
| Light microscope | |||
| 37 °C water bath | |||
| Laminar flow cell culture hood | |||
| High-temperature dry-oven | |||
| Bunsen burner | |||
| Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C) | |||
| Microcentrifuge | |||
| Orbital shaker | |||
| Nikon structured illumination microscope setup consisting of: | |||
| Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System | |||
| Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49) | |||
| 4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength) | |||
| SIM Illuminator | |||
| Nikon Stage Controller | |||
| MCL Nano-Drive piezo controller | |||
| Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp | |||
| SIM Microscope Enclosure temperature control | |||
| Andor EM-CCD Camera iXon DU897 | |||
| PC with Microsoft Windows 7 Home Edition | |||
| Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package | |||
| Nikon type A immersion oil |
Riferimenti
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