הדמיה קוצים הדנדריטים של העכברוש הראשי נוירונים בהיפוקמפוס באמצעות מובנה תאורה מיקרוסקופית
Summary
מאמר זה מתאר פרוטוקול עבודה לקוצים הדנדריטים תמונה מתא העצב בהיפוקמפוס במבחנה באמצעות מובנה תאורה מיקרוסקופית (SIM). מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר באמצעות ה-SIM מספקת רזולוציית תמונה באופן משמעותי מעבר לגבול השתברות האור בכל שלושת הממדים מרחביים, המאפשרת ההדמיה של קוצים הדנדריטים בודדים עם פירוט משופר.
Abstract
קוצים הדנדריטים הם בליטות המתעוררות מדנדריט של נוירון ולייצג את מטרות postsynaptic העיקריות של תשומות מעוררות במוח. התקדמות טכנולוגית זיהו את המבנים האלה כמרכיבים מרכזיים בקישוריות נוירון ופלסטיות הסינפטית. ניתוח כמותי של מורפולוגיה עמוד השדרה באמצעות מיקרוסקופ אור נותר בעיה מהותית בשל מגבלות טכניות הקשורות לגבול השבירה הפנימי של האור. קוצים הדנדריטים יכולים להיות מזוהים בקלות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לייזר הסריקה confocal. עם זאת, מדידת שינויים עדינים בצורה ובגודל של עמוד השדרה קשה בגלל ממדי עמוד השדרה אחרים מאשר אורך הם בדרך כלל קטנים יותר מרזולוציה אופטית קונבנציונלית שנקבעה על ידי גבול הרזולוציה התיאורטי של מיקרוסקופ אור של 200 ננומטר.
טכניקות ברזולוציה כמה שפותחו לאחרונה סופר כבר בעבר מבנים הסלולר תמונה קטנים יותר מננומטר 200, כולל קוצים הדנדריטים. Tטכניקות hese מתבססות על פעילות שדה הרחוק קלאסית ולכן מאפשרות השימוש בשיטות הכנת מדגם קיימות ולתמונה מעבר לפני השטח של דגימה. שתואר כאן הוא פרוטוקול עבודה ליישם מיקרוסקופיה ברזולוציה מובנה סופר תאורה (SIM) להדמיה של קוצים הדנדריטים בתרבויות נוירון היפוקמפוס עיקריות. יישומים אפשריים של ה-SIM חפיפה עם אלו של מיקרוסקופיה confocal. עם זאת, שתי הטכניקות להציג תחולה שונה. SIM מציע רזולוציה רוחב אפקטיבית גבוה יותר, ואילו מיקרוסקופיה confocal, בשל השימוש בחריר פיזי, משיגה שיפור רזולוציה על חשבון הסרת מחוץ לפוקוס אור. בפרוטוקול זה, הנוירונים עיקריים הם תרבותיים על coverslips זכוכית באמצעות פרוטוקול סטנדרטי, transfected עם פלסמידים-DNA המקודדים חלבוני ניאון וצלמו באמצעות ה-SIM. כל הפרוטוקול המתואר במסמך זה לוקח כ 2 שבועות, בגלל קוצים הדנדריטים הם צילמו אחרי 16-17 ימים במבחנה, כאשרהתפתחות דנדריטים היא אופטימלית. לאחר השלמת הפרוטוקול, ניתן לשחזר קוצים הדנדריטים ב3D מסדרה של ערימות תמונת ה-SIM באמצעות תוכנה מיוחדת.
Introduction
עמוד השדרה הדנדריטים היא בליטה קטנה של קרום תא העצב. מבנה אופייני זו מתמחה לקבל בדרך כלל קלט מסינפסה אחת ומייצג את שטח המגע הפיזי בין שני תאי עצב. רוב הקוצים הדנדריטים תפקודי בוגרים מורכבים מקצה כדורי, ראש כינה, וצוואר דק שמחבר את הראש לפיר הדנדריטים. עם זאת, עמוד השדרה אינה סטטיים ופעיל להעביר ולשנות את המורפולוגיה שלהם ברציפות גם במוח הבוגר 2. בתוך פרק 2 בשבוע של זמן, תרבויות נוירון בהיפוקמפוס עכברוש העיקרי נובעות מזמן שלאחר לידה עוברי או בתחילת סוף לפתח סוכות הדנדריטים מורכבות עם בליטות קרום רבות שתתפתחנה מfilipodia המוקדם למבנים דמויי עמוד השדרה-3. בהתבסס על התנהגות דינמית זו ומאפיינים אחרים, קוצים הדנדריטים הם חשבו לספק מצע אנטומיים לאחסון זיכרון ו4,5 שידור סינפטי.
בהינתן הדואר תפקיד קריטי שגודל עמוד השדרה הדנדריטים וצורה שבתפקוד הסינפטי, חשוב למדוד את הממדים שלהם בצורה מדויקת. עמוד השדרה משתנה מסביב 200 ל -2,000 ננומטר באורך וניתן לזהות בקלות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לייזר הסריקה confocal. עם זאת, ממדי עמוד השדרה אחרים מאשר אורך הם בדרך כלל מתחת לרזולוציה של המערכות אופטיות הקונבנציונלית, הקבוע באופן תיאורטי על ידי עקיפה סביב 200 ננומטרים 6. כוחות פתרון אלה אינם מספיקים להדמית פרטים מעודנים יותר, כגון הרוחב של צוואר עמוד השדרה וראשים. עבודה רבה הוקדשה לפתור את הבעיה הזו ושיטות מיקרוסקופיה רבות חדשות יחסית ברזולוציה הסופר סיפקו התקדמות משמעותית. בפרט, זה אפשרי כדי להשיג רזולוציה מעבר לגבול הקלאסי, בלי לזנוח את כל אור פליטה באמצעות מיקרוסקופיה תאורה מובנה רוחבי (SIM) בשדה רחב, מיקרוסקופ שאינו confocal 7-10. שימוש בטכניקה זו בשילוב עם אי – Lineaשיטות מיקרוסקופיה r, זה אפשרי תיאורטית לשפר את הרזולוציה לרוחב של מיקרוסקופ האופטי על ידי גורם בלתי מוגבל 11. עם זאת, ברוב מקרי ניסיוני, ה-SIM מאפשר לעלות את מגבלת הרזולוציה בפקטור של שתי 1. טכניקות מיקרוסקופיה אופטית אחרות רזולוציה סופר כגון מיקרוסקופיה דלדול פליטה מאולצת (STED) 12 ומיקרוסקופיה לוקליזציה צילום הפעלה (PALM) 12 הוחלו על הדמיה של קוצים הדנדריטים. שיטות המבוססת על לוקליזציה כגון PALM דורשות מספר גדול מאוד של תמונות גולמיות כדי להשיג רזולוציה סופר ולכן הם מוגבלים במהירות. מצד השני, STED יכולה להשיג מהירות גבוהה הדמיה, אם כי בספירת פוטון נמוכה יחסית ושדות קטנים של תצוגה, אשר לא יכול להיות במקרה של 13 ה-SIM.
במאמר זה המטרה היא לספק פרוטוקול עבודה לקוצים הדנדריטים תמונה מתא העצב בהיפוקמפוס עיקרי חולדה בתרבית במבחנה </em> באמצעות ה-SIM. הפרוטוקול מורכב משני שלבים מובחנים: אחד ראשוני בהיקף של ההקמה, פיתוח, transfection ואימונוהיסטוכימיה של תרבויות נוירון עכברוש עיקריות בהיפוקמפוס ושלב מאוחר המוקדש לדגום הדמיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה פרוטוקול עבודה לקוצים הדנדריטים תמונה מתא העצב בהיפוקמפוס עיקרי חולדה בתרבית במבחנה באמצעות ה-SIM הוא תאר. שיטת תרבות נוירון היפוקמפוס העיקרית היא עיבוד של השיטה המקורית שתוארה על ידי Kaech והבנקאי 18. ההבדלים העיקריים הם השימוש במדיום Neurobasal/B27 תרבות, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי H64.09.016 מספר מענק vidi מארגון הולנד למחקר מדעי (NWO) לCPF. ע.מ. מודה לד"ר סילבינה א Fratantoni להערות הביקורתיים שלה ותיקונים בכתב היד הסופית. GMRDL / EMMM נתמך על ידי ההולנדים הטכנולוגיה הקרן STW (12151 פרויקט ו11350), שהוא חלק מההסתדרות הלאומית, ואשר ממומן בחלקו על ידי המשרד לענייני כלכלה. אנו מודים קיטס קתרין ופיטר Drent של ניקון מכשירי Europe BV לקבלת סיוע ותמיכה. HX נתמכה על ידי האקדמיה ההולנדית המלכותית לאמנויות ולמדעים (מענק 11CDP10) וWT נתמכה על ידי מענק בארגון ההולנדי למחקר מדעי (מענק 820.02.006).
Materials
| Fine forceps | |||
| Big forceps | |||
| Fine scissor | |||
| Big scissor | |||
| Blunt spatula | |||
| Dissecting microscope with illumination | |||
| Light microscope | |||
| 37 °C water bath | |||
| Laminar flow cell culture hood | |||
| High-temperature dry-oven | |||
| Bunsen burner | |||
| Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C) | |||
| Microcentrifuge | |||
| Orbital shaker | |||
| Nikon structured illumination microscope setup consisting of: | |||
| Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System | |||
| Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49) | |||
| 4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength) | |||
| SIM Illuminator | |||
| Nikon Stage Controller | |||
| MCL Nano-Drive piezo controller | |||
| Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp | |||
| SIM Microscope Enclosure temperature control | |||
| Andor EM-CCD Camera iXon DU897 | |||
| PC with Microsoft Windows 7 Home Edition | |||
| Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package | |||
| Nikon type A immersion oil |
Riferimenti
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Curr Opin Neurobiol. 19, 146-153 (2009).
- Dailey, M. E., Smith, S. J. The dynamics of dendritic structure in developing hippocampal slices. J Neurosci. 16, 2983-2994 (1996).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
- Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61, 85-100 (2009).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9, 413-418 .
- Gustafsson, M. G., Agard, D. A., Sedat, J. W. I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution. J Microsc. 195, 10-16 (1999).
- Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. Proc. SPIE 3568 Optical Biopsies and Microscopic Techniques III. , 185-196 (1999).
- Karadaglić, D., Wilson, T. Image formation in structured illumination wide-field fluorescence microscopy. Micron. 39, 808-818 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320, 1332-1336 (2008).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13081-13086 (2005).
- Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 18982-18987 (2008).
- Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat Methods. 6, 339-342 (2009).
- James, C. D., et al. Aligned microcontact printing of micrometer-scale poly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planar microelectrode arrays. IEEE Trans Biomed Eng. 47, 17-21 (2000).
- Dumitriu, D., Rodriguez, A., Morrison, J. H. High-throughput, detailed, cell-specific neuroanatomy of dendritic spines using microinjection and confocal microscopy. Nat Protoc. 6, 1391-1411 (2011).
- Fitzsimons, C. P., et al. Knockdown of the glucocorticoid receptor alters functional integration of newborn neurons in the adult hippocampus and impairs fear-motivated behavior. Mol Psychiatry. , (2012).
- van Hooijdonk, L. W., et al. Lentivirus-mediated transgene delivery to the hippocampus reveals sub-field specific differences in expression. BMC Neurosci. , (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Izeddin, I., et al. Super-resolution dynamic imaging of dendritic spines using a low-affinity photoconvertible actin probe. PLoS ONE. 6, (2011).
