Imagiologia espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo de rato primária usando Structured Illumination Microscopy
Summary
Este artigo descreve um protocolo de trabalho de imagem espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo in vitro utilizando Structured Illumination Microscopy (SIM). Microscopia Super-resolução usando SIM oferece resolução de imagem significativamente além do limite de difração da luz em todas as três dimensões espaciais, permitindo que a imagem de espinhas dendríticas individuais com maior pormenor.
Abstract
As espinhas dendríticas são saliências emergentes da dendrite de um neurónio e representam os alvos primários pós-sinápticos de entradas excitatórios no cérebro. Os avanços tecnológicos têm identificado estas estruturas como elementos-chave na conectividade neuronal e plasticidade sináptica. A análise quantitativa da morfologia da coluna usando microscopia de luz continua a ser um problema essencial, devido a limitações técnicas associadas limite intrínseco da refração da luz. Espinhas dendriticas podem ser prontamente identificados por microscopia de fluorescência confocal de varrimento laser. No entanto, medindo mudanças sutis na forma e tamanho de espinhos é difícil, porque outros do que o comprimento da coluna dimensões são geralmente menores do que a resolução óptica convencional fixada por limite de resolução teórico de microscopia de luz de 200 nm.
Várias técnicas de resolução de super recentemente desenvolvidos têm sido utilizados para imagem estruturas celulares menores do que os 200 nm, incluindo espinhas dendriticas. Tstas técnicas baseiam-se em operações de campo distante clássicos e, por conseguinte, permitir a utilização de métodos de preparação de amostras existentes e para além da imagem da superfície de uma amostra. Descrito aqui é um protocolo de trabalho para aplicar resolução estruturada microscopia de iluminação super (SIM) para a imagem das espinhas dendríticas em culturas de neurônios do hipocampo primários. Possíveis aplicações de SIM coincidir com os de microscopia confocal. No entanto, as duas técnicas apresentam aplicabilidade diferente. SIM oferece resolução lateral superior eficaz, ao passo que a microscopia confocal, devido ao uso de um orifício físico, atinge melhoria resolução à custa da remoção de luz fora de foco. Neste protocolo, neurónios primários são cultivadas em lamelas de vidro, utilizando um protocolo padrão, transfectados com os plasmídeos de DNA que codificam as proteínas fluorescentes e fotografadas usando SIM. Todo o protocolo aqui descrito leva aproximadamente duas semanas, porque espinhas dendríticas são visualizados após 16-17 dias in vitro, quandodesenvolvimento dendrítica é o ideal. Após a conclusão do protocolo, espinhas dendríticas pode ser reconstruído em 3D da série de pilhas de imagens do SIM usando software especializado.
Introduction
A espinha dendrítica é uma pequena saliência da membrana neuronal. Esta estrutura característica é especializada para receber normalmente a entrada de uma única sinapse e representa a área de contato físico entre os dois neurônios. A maioria das espinhas dendríticas funcionalmente maduros consistem em uma ponta globular, denominado cabeça e um pescoço fino que liga a cabeça ao eixo dendrítica. No entanto, as espinhas não são estáticos e mover e alterar a sua morfologia ainda continuamente no cérebro adulto 2 activamente. Dentro de um período de 2 semanas de tempo, ratos culturas de neurônios do hipocampo primários derivados de tempo pós-natal embrionária ou início de tarde desenvolver árvores dendríticas complexas com inúmeras saliências membrana que evoluem a partir de filipodia cedo para estruturas da coluna-como 3. Com base nesse comportamento dinâmico e outras características, espinhas dendríticas são pensados para proporcionar um substrato anatômico para o armazenamento de memória e 4,5 transmissão sináptica.
Dada ªe papel crítico que o tamanho da espinha dendrítica e forma têm em função sináptica, é importante para medir com precisão as suas dimensões. Espinhas variam de cerca de 200 a 2000 nanómetros de comprimento e pode ser facilmente identificado por microscopia de fluorescência confocal de varrimento laser. No entanto, outras dimensões do que o comprimento da coluna vertebral são geralmente abaixo de resolução dos sistemas ópticos convencionais, teoricamente fixo por difração de cerca de 200 nanômetros de 6. Esses poderes são insuficientes para resolver imaginando pequenos detalhes, como a largura da coluna pescoços e cabeças. Muito trabalho foi dedicado a resolver este problema e muitos relativamente novas técnicas de microscopia de super-resolução proporcionaram um progresso substancial. Em particular, é possível obter uma resolução para além do limite clássico sem descartar qualquer emissão de luz por meio de microscopia de iluminação estruturada lateralmente (SIM), numa vasta área, microscópio confocal não 7-10. Usando esta técnica, em combinação com os não-lineatécnicas de microscopia de r, que é teoricamente possível a melhorar a resolução lateral do microscópio óptico de um factor 11 ilimitado. No entanto, na maioria das circunstâncias experimentais, de SIM permite ultrapassar o limite de resolução por um factor de dois 1. Outros super-resolução técnicas de microscopia óptica, tais como esgotamento emissão estimulada (STED) microscopia 12 e microscopia localização foto-ativação (PALM) 12 foram aplicadas à imagem das espinhas dendríticas. Métodos baseados em localização, como PALM requerem um grande número de imagens raw para atingir super-resolução e, portanto, são limitados em velocidade. Por outro lado, STED pode alcançar alta velocidade de imagem, embora a contagem relativamente baixos de fótons e pequenos campos de visão, que podem não ser o caso do SIM 13.
Neste artigo, o objetivo é fornecer um protocolo de trabalho para imagem espinhas dendríticas de neurônios do hipocampo de ratos primários cultivados in vitro </em> usando SIM. O protocolo consiste em duas fases distintas: inicial consistindo de estabelecimento, desenvolvimento, transfecção e imunohistoquímica de ratos principais culturas de neurônios do hipocampo e uma fase tardia dedicado a provar imagem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo um protocolo de trabalho para imagem espinhas dendríticas de neurônios do hipocampo de ratos primários cultivados in vitro utilizando SIM é descrito. O método de cultura de neurônios do hipocampo principal é uma adaptação do método original descrito por Kaech e Banker 18. As principais diferenças são a utilização de meio de cultura Neurobasal/B27, o que elimina a necessidade de culturas astrogliais alimentadoras, e a adição do inibidor mitótico FUDR no dia 3, que promove…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma H64.09.016 VIDI número de concessão da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO) para CPF. CPF é grato ao Dr. Silvina A. Fratantoni por seus comentários críticos e correções sobre o manuscrito final. GMRDL / Emmm são suportados pelo holandês Tecnologia Fundação STW (12151 projeto e 11350), que faz parte da NWO, e que é parcialmente financiado pelo Ministério dos Assuntos Económicos. Agradecemos a Catherine Cristóvão e Peter Drent da Nikon Instruments Europe BV para a assistência e apoio. HX foi apoiado pela Royal Dutch Academia de Artes e Ciências (concessão 11CDP10) e WT foi apoiado pela concessão da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (concessão 820.02.006).
Materials
| Fine forceps | |||
| Big forceps | |||
| Fine scissor | |||
| Big scissor | |||
| Blunt spatula | |||
| Dissecting microscope with illumination | |||
| Light microscope | |||
| 37 °C water bath | |||
| Laminar flow cell culture hood | |||
| High-temperature dry-oven | |||
| Bunsen burner | |||
| Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C) | |||
| Microcentrifuge | |||
| Orbital shaker | |||
| Nikon structured illumination microscope setup consisting of: | |||
| Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System | |||
| Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49) | |||
| 4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength) | |||
| SIM Illuminator | |||
| Nikon Stage Controller | |||
| MCL Nano-Drive piezo controller | |||
| Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp | |||
| SIM Microscope Enclosure temperature control | |||
| Andor EM-CCD Camera iXon DU897 | |||
| PC with Microsoft Windows 7 Home Edition | |||
| Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package | |||
| Nikon type A immersion oil |
Riferimenti
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