Imaging spine dendritiche di Rat Primaria neuroni dell'ippocampo utilizzando Structured Illumination Microscopy
Summary
Questo articolo descrive un protocollo di lavoro di immagine spine dendritiche di neuroni dell'ippocampo in vitro utilizzando Structured Illumination Microscopy (SIM). Microscopia super-risoluzione usando SIM fornisce risoluzione di immagine notevolmente oltre il limite di diffrazione della luce in tutte le tre dimensioni spaziali, permettendo l'imaging di singole spine dendritiche con maggiore dettaglio.
Abstract
Spine dendritiche sono sporgenze che emergono dal dendrite di un neurone e rappresentano gli obiettivi primari di ingressi postsinaptici eccitatori nel cervello. I progressi tecnologici hanno identificato queste strutture come elementi fondamentali di connettività neuronale e nella plasticità sinaptica. L'analisi quantitativa della morfologia della colonna vertebrale mediante microscopia ottica resta un problema essenziale a causa di limitazioni tecniche connesse con il limite intrinseco di rifrazione della luce. Spine dendritiche possono essere facilmente identificati da confocale a scansione laser microscopia a fluorescenza. Tuttavia, misurando sottili cambiamenti nella forma e dimensioni delle spine è difficile perché le dimensioni della colonna vertebrale diverse lunghezza sono generalmente più piccole rispetto alla risoluzione ottica convenzionale fissata dal limite di risoluzione teorica di microscopia luce di 200 nm.
Diverse tecniche di risoluzione di super sviluppate recentemente sono stati utilizzati per immagine strutture cellulari di dimensioni inferiori a 200 nm, comprese le spine dendritiche. Tueste tecniche sono basate su operazioni di campo lontano classici e consentono quindi l'uso di metodi di preparazione dei campioni esistenti e di immagine oltre la superficie di un campione. Qui descritto è un protocollo di lavoro per applicare la risoluzione strutturata eccellente illuminazione microscopia (SIM) per l'imaging di spine dendritiche in colture di neuroni ippocampali primarie. Le possibili applicazioni di SIM si sovrappongono con quelli della microscopia confocale. Tuttavia, le due tecniche presentano differente applicabilità. SIM offre risoluzione laterale maggiore efficacia, mentre microscopia confocale, grazie all'utilizzo di un pinhole fisica, raggiunge miglioramento risoluzione a scapito della rimozione di fuori fuoco luce. In questo protocollo, neuroni primari sono coltivate su vetrini utilizzando un protocollo standard, trasfettate con plasmidi di DNA codificanti proteine fluorescenti e ripreso con SIM. L'intero protocollo qui descritto dura circa due settimane, perché spine dendritiche vengono esposte dopo 16-17 giorni in vitro, quandosviluppo dendritico è ottimale. Dopo il completamento del protocollo, spine dendritiche possono essere ricostruiti in 3D da una serie di SIM stack di immagini utilizzando software specializzati.
Introduction
Una spina dendritica è una piccola protrusione della membrana del neurone. Questa caratteristica struttura è specializzata per ricevere tipicamente ingresso di una singola sinapsi e rappresenta l'area di contatto fisico tra due neuroni. La maggior parte delle spine dendritiche funzionalmente maturi sono costituiti da una punta globulare, testa definito, e un collo sottile che collega la testa all'albero dendritica. Tuttavia, spine non sono statici e si muovono attivamente e cambiano la loro morfologia continuamente anche nel cervello adulto 2. Entro un periodo di due settimane di tempo, colture primarie di neuroni dell'ippocampo di ratto derivati da tempo postnatale ritardo embrionale o all'inizio sviluppano complessi pergole dendritiche con numerose sporgenze di membrana che si evolvono da inizio filipodia alle strutture della colonna vertebrale, come 3. Sulla base di questo comportamento dinamico e le altre caratteristiche, spine dendritiche sono pensati per fornire un substrato anatomico per memorizzazione e 4,5 trasmissione sinaptica.
Dato the il ruolo fondamentale che le dimensioni spina dendritica e la forma sono in funzione sinaptica, è importante misurare le dimensioni con precisione. Spine variano da circa 200 a 2.000 nanometri di lunghezza e possono essere facilmente identificati da confocale a scansione laser microscopia a fluorescenza. Tuttavia, le dimensioni della colonna vertebrale diversi lunghezza sono di solito sotto la risoluzione dei tradizionali sistemi ottici ', teoricamente fissato dalla diffrazione di circa 200 nanometri 6. Questi poteri non sono sufficienti per risolvere l'imaging più fini dettagli, come la larghezza della colonna vertebrale colli e teste. Molto lavoro è stato dedicato a risolvere questo problema e molte relativamente nuove tecniche di microscopia a super-risoluzione hanno fornito notevoli progressi. In particolare, è possibile ottenere una risoluzione al di là del limite classico senza scartare alcuna emissione di luce utilizzando lateralmente strutturato microscopia illuminazione (SIM) in un ampio campo, microscopio confocale non 7-10. Utilizzando questa tecnica in combinazione con non-lineatecniche di microscopia r, è teoricamente possibile migliorare la risoluzione laterale del microscopio ottico per un fattore di merito 11. Tuttavia, nella maggior parte dei casi sperimentali, SIM consente di superare il limite di risoluzione di un fattore due 1. Altri super-risoluzione di tecniche di microscopia ottica, quali l'esaurimento emissione stimolata (STED) microscopia a 12 e la foto-attivazione di localizzazione di microscopia (PALM) 12 sono stati applicati alla rappresentazione delle spine dendritiche. Metodi basati localizzazione, come ad esempio PALM richiedono un gran numero di immagini raw per ottenere super-risoluzione e sono quindi limitati nella velocità. D'altra parte, STED può ottenere un'elevata velocità di esposizione, sebbene relativamente basso numero di fotoni e piccoli campi di vista, che non può essere il caso per SIM 13.
In questo articolo l'obiettivo è quello di realizzare un protocollo di lavoro di immagine spine dendritiche di neuroni ippocampali di ratto primari in coltura in vitro </em> utilizzando SIM. Il protocollo si compone di due fasi distinguibili: uno iniziale composto di stabilimento, lo sviluppo, trasfezione ed immunoistochimica delle primarie colture di neuroni dell'ippocampo di ratto e una fase tardiva dedicata al campione di imaging.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo viene descritto un protocollo di lavoro di immagine spine dendritiche di topo neuroni primari in coltura in vitro utilizzando SIM. Il metodo di coltura neurone dell'ippocampo primaria è un adattamento del metodo originale descritto da Kaech e Banker 18. Le differenze principali sono l'uso di Neurobasal/B27 terreno di coltura, che elimina la necessità di culture alimentazione astrogliali, e l'aggiunta del FUDR inibitore mitotico il giorno 3 che promuove la sopravvivenz…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da un numero di licenza VIDI H64.09.016 da L'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO) per CPF. CPF è grato al Dott. Silvina A. Fratantoni per i suoi commenti critici e correzioni sul manoscritto finale. GMRDL / emmm sono supportati dagli olandesi Technology Foundation STW (progetto 12151 e 11350), che fa parte del NWO, e che è in parte finanziato dal Ministero degli Affari economici. Ringraziamo l'Catherine Kitts e Peter Drent di Nikon Instruments Europe BV per l'assistenza e il supporto. HX è stato sostenuto dalla Reale Accademia Olandese delle Arti e delle Scienze (sovvenzione 11CDP10) e WT è stata sostenuta dalla sovvenzione Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (sovvenzione 820.02.006).
Materials
| Fine forceps | |||
| Big forceps | |||
| Fine scissor | |||
| Big scissor | |||
| Blunt spatula | |||
| Dissecting microscope with illumination | |||
| Light microscope | |||
| 37 °C water bath | |||
| Laminar flow cell culture hood | |||
| High-temperature dry-oven | |||
| Bunsen burner | |||
| Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C) | |||
| Microcentrifuge | |||
| Orbital shaker | |||
| Nikon structured illumination microscope setup consisting of: | |||
| Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System | |||
| Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49) | |||
| 4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength) | |||
| SIM Illuminator | |||
| Nikon Stage Controller | |||
| MCL Nano-Drive piezo controller | |||
| Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp | |||
| SIM Microscope Enclosure temperature control | |||
| Andor EM-CCD Camera iXon DU897 | |||
| PC with Microsoft Windows 7 Home Edition | |||
| Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package | |||
| Nikon type A immersion oil |
Riferimenti
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