構造化照明顕微鏡を用いてラット初代海馬ニューロンの樹状突起棘を画像化
Summary
この記事では、構造化照明顕微鏡（SIM）を使用してインビトロで海馬ニューロンからイメージ樹状突起棘にワーキングプロトコルについて説明します。 SIMを使用して超解像顕微鏡法は、改善されたディテール個体樹状突起棘の画像化を可能にする、有意にすべての3つの空間次元における光の回折限界を超えて画像解像度を提供する。
Abstract
樹状突起棘は、ニューロンの樹状突起から出た突起であり、脳内の興奮性の入力の主要なシナプス後目標を表すものです。技術の進歩は、ニューロンの接続性とシナプス可塑性において重要な要素として、これらの構造を同定した。光学顕微鏡を用いてスパイン形態の定量分析は、光の固有屈折限界に関連する技術的制限による本質的な問題のまま。樹状突起棘は、容易に共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡により同定することができる。長さ以外の脊椎寸法は、通常、200nmの光学顕微鏡法の理論的な解像限界により固定され、従来の光学分解能よりも小さいので、棘の形状及び大きさの微妙な変化を測定することは困難である。
いくつかの最近開発された超解像技術は、樹状突起棘を含む200nmよりも小さい画像の細胞構造に使用されてきた。 Tヘセ技術は、古典的なファーフィールドの動作に基づいており、したがって、既存の試料調製方法の使用を可能にし、試料の表面を越えて画像にしている。ここで説明するには、初代海馬ニューロン培養中の樹状突起棘の画像に超解像構造化照明顕微鏡（SIM）を適用するための作業プロトコルです。 SIMの可能なアプリケーションでは、共焦点顕微鏡のものと重複する。しかし、2つの技術が異なる適用可能性を提示する。共焦点顕微鏡は、物理的なピンホールの使用にフォーカス光のうちの除去を犠牲にして高解像度化を実現しながら、SIMは、より高い実効横方向の解像度を提供しています。このプロトコルでは、一次ニューロンは、DNAプラスミドは、蛍光タンパク質をコードし、SIMを使用して撮像をトランスフェクトした標準プロトコルを使用して、ガラスカバースリップ上で培養される。樹状突起棘の際に、in vitroで 16〜17日後に画像化されているため、ここに記載さ全体プロトコルは、約2週間かかります樹状開発が最適である。プロトコルの完了後に、樹状突起棘は、特殊なソフトウェアを使用してSIM画像スタックの一連の3Dで再構成することができる。
Introduction
樹状突起棘は、ニューロン膜の小さな突起である。この特徴的な構造は、典型的には、単一のシナプスからの入力を受信するように特化され、2つのニューロン間の物理的接触面積を表している。最も機能的に成熟した樹状突起棘は、球状チップで構成されて頭と呼ばれ、樹状シャフトにヘッドを接続している細い首。しかし、棘は静的ではなく、積極的に移動しても、成人の脳2で連続的にその形態を変更してください。時間の2週間の期間内に、後半胚または出生後早期の時間に由来したラット初代海馬ニューロン培養は、背骨状の構造3への早期糸状仮足から進化し、多数の膜突起を持つ複雑な樹状アーバーを開発しています。この動的挙動および他の特性に基づいて、樹状突起棘は、メモリ記憶およびシナプス伝達のために、4,5の解剖学的基質を提供すると考えられている。
目の与えられた樹状突起棘の大きさと形状がシナプス機能で、それは正確に寸法を測定することが重要ですしていることをE重要な役割。棘は、長さが約200〜2000ナノメートルまで変化と容易に共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡により同定することができる。しかし、長さ以外の脊椎の寸法は、理論的には200ナノメートル6周りの回折によって固定され、通常は従来の光学システム「解像度を下回っている。これらの解決の力は、脊椎のネックとヘッドの幅など細かい詳細を画像化するには不十分である。多くの研究は、この問題を解決するために専用されており、多くの比較的新しい超解像顕微鏡技術は、実質的な進歩を提供した。特に、広視野、非共焦点顕微鏡7-10に横方向に構造化照明顕微鏡（SIM）を使用して任意の発光光を廃棄することなく、古典的な限界を超えた分解能を達成することができる。非リネアと組み合わせてこの技術を用いてr個の顕微鏡技術は、無制限の因子11によって光学顕微鏡の方位分解能を向上させることが理論的に可能である。しかし、ほとんどの実験状況で、SIMは2 1倍に解像限界を超えることができます。このような誘導放出の枯渇（STED）顕微鏡12と光活性化局在化顕微鏡法（PALM）12のような他の超解像光学顕微鏡技術は、樹状突起棘の撮像に適用されている。例えば、PALM等の局在に基づく方法は、超解像を達成するために、原画像の非常に多数を必要とするので、速度が制限される。一方、STEDは、高い画像形成速度を達成することができ、比較的低い光子カウントとSIM 13には当てはまらないかもしれない視野の小さな分野、ではあるが。
この記事では目的は、 試験管内で培養したラット初代海馬ニューロンからの画像樹状突起棘に努めプロトコルを提供するものである</EM> SIMを使用。ラット初代海馬ニューロン培養の確立、開発、トランスフェクションおよび免疫組織化学からなる最初の1とイメージングをサンプリングするために専用の後期相：プロトコルは、2つの区別可能な段階で構成されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、SIMを使用して、in vitroで培養したラット初代海馬ニューロンからの画像樹状突起棘の作業プロトコルが記述されている。初代海馬神経細胞培養法は、Kaechとバンカー18で説明した独自の方法を最適化したものです。主な違いは、をNeurobasal/B27培養アストログリア細胞フィーダー培養の必要性を排除する媒体、およびグリア細胞の増殖を抑制しつつ、ブリューワー<em…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、CPFに科学研究費オランダ機構（NWO）からビディ承認番号H64.09.016によって賄われた。 CPFは、最終原稿の彼女の批判的コメントと修正のための博士SilvinaさんA. Fratantoniに感謝です。 GMRDL / EMMM NWOの一部であり、オランダの技術振興財団STW（プロジェクト12151および11350）によってサポートされており、その一部は経済省によって資金を供給されています。私たちは、援助と支援のため、ニコンインスツルメンツヨーロッパBVのキャサリンクリストファー·ピーターDrentに感謝します。 HX助成科学研究費オランダ機構（助成820.02.006）によってサポートされていましたロイヤル·ダッチ·芸術科学アカデミー（助成11CDP10）とWTによってサポートされていました。
Materials
| Fine forceps | |||
| Big forceps | |||
| Fine scissor | |||
| Big scissor | |||
| Blunt spatula | |||
| Dissecting microscope with illumination | |||
| Light microscope | |||
| 37 °C water bath | |||
| Laminar flow cell culture hood | |||
| High-temperature dry-oven | |||
| Bunsen burner | |||
| Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C) | |||
| Microcentrifuge | |||
| Orbital shaker | |||
| Nikon structured illumination microscope setup consisting of: | |||
| Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System | |||
| Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49) | |||
| 4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength) | |||
| SIM Illuminator | |||
| Nikon Stage Controller | |||
| MCL Nano-Drive piezo controller | |||
| Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp | |||
| SIM Microscope Enclosure temperature control | |||
| Andor EM-CCD Camera iXon DU897 | |||
| PC with Microsoft Windows 7 Home Edition | |||
| Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package | |||
| Nikon type A immersion oil |
Riferimenti
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