Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

באתרו איתור של חיידקים בתוך רקמות מוטבעות-פרפין באמצעות DNA בדיקה שכותרת Digoxin מיקוד 16S rRNA

Published: May 21, 2015 doi: 10.3791/52836
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Oral Microbiology and Immunology, School of Dentistry and Dental Research Institute, Seoul National University

Introduction

חיידקים לשחק תפקיד באטיולוגיה של מחלות פה שונות כגון חניכיים, דַלֶקֶת הַמוֹך, pericoronitis, צלוליטיס, ודלקת עצם. על מנת להבין את תפקידם של חיידקים בפתוגנזה של מחלה ולעקוב אחר ההשפעה של טיפולים, לוקליזציה של חיידקים בתוך הרקמה חשובה. הנוכחות של חיידקים בתוך רקמת חניכיים מחולים עם מחלת חניכיים הוכחה בשיטות שונות, כולל מיקרוסקופ אלקטרונים 1,2, אימונוהיסטוכימיה וimmunofluorescence באמצעות חיידקים ספציפיים נוגדנים 3-7, וניאון הכלאה באתר (דגים) 8 באמצעות fluorescence- הבדיקה oligonucleotide שכותרתו מיקוד rRNA 16S. עם זאת, שיטות אלה אינן בשימוש נרחב בשל מגבלה או קשיים טכניים. לעומת נוגדנים, בדיקות מיקוד rRNA 16S קלות לייצר ולהשיג מינים-סגוליות. FISH הוכיח להיות כלי מצוין להדמיה של התרהeria בסביבתם הטבעית כגון biofilm שלט. עם זאת, יישום של דגים לדגימות רקמה מוגבל בשל autofluorescence של רכיבי רקמות שונים. לדוגמא, autofluorescence החזק של תאי דם אדומים לעתים קרובות מעכב את היישום של טכנולוגית הקרינה לרקמות מודלקות כשהם כרוכים בדימום 9.

כדי למקם חיידקים בתוך רקמות החניכיים המודלקות, ולכן, באתר שיטת הכלאה באמצעות digoxigenin (DIG) הבדיקה DNA -labeled פותחה ומיושמת בהצלחה 10,11. כאן פרוטוקול מפורט ללוקליזציה של חיידקים בתוך רקמות מוטבעים פרפין באמצעות פ בדיקות eubacterial -specific והאוניברסליות gingivalis תוארו. הוא התמקד בעיקר בסטנדרטיזציה של השיטה כדי שניתן תהיה לשכפל תוצאות דומות במעבדות אחרות. פרוטוקול זה מאפשר לוקליזציה של חיידקים בתוך ההקשר היסטולוגית שלהם וresuLTS הם מאוד לשחזור. הפרוטוקול המתואר ניתן להשתמש כדי למקם חיידקים או באופן מינים ספציפיים או אוניוורסלי ברקמות שונות. הבדיקה האוניברסלית שימושית במיוחד כדי לזהות חיידקים במחלות polymicrobial וללמוד את תפקיד פוטנציאלי של חיידקים במחלות שבי התפקיד של חיידקים מסוימים אינו ידוע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בדיקה הכנה

  1. ההגברה PCR של החללית
    1. לפ הבדיקה -specific gingivalis, להגביר קטע DNA 343-נ"ב של פ rRNA 16S gingivalis על ידי PCR באמצעות הדנ"א הגנומי של פ gingivalis ופריימרים הבאים: 5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 'ו5'- ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3' 10. בצע amplifications עם תנאי המחזור הבאים: 35 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות 20 שניות אחרי ארכה 5 דקות ב 72 מעלות צלזיוס 10,11.
    2. להגביר את הבדיקה eubacterial באמצעות 70-נ"ב קטע DNA (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG
      TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 ') מסונתזים כoligonucleotide ופריימרים הבאים: 5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' ו5'-AGG GTT GCG CTC 11 'GTT-3. בצע amplifications עם תנאי המחזור הבאים: 40 מחזוריםבשעה 9 4 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות 20 שניות אחרי ארכה 5 דקות ב 72 מעלות צלזיוס 11,12.
    3. לזרז את מוצרי ה- PCR (≥500 μl) על ידי הוספת 3 נתרן אצטט M (pH 5.2) ואתנול 100% (ב- 10: 1: 2 יחס) ודוגרים ב -20 ° C לשעה 2.
    4. צנטריפוגה את התערובת על 14,000 XG במשך 15 דקות, resuspend גלולה במאגר TE 100 של μl, ולמדוד את ריכוז ה- DNA על ידי צפיפות אופטית ב 260 ננומטר.
  2. DIG-תיוג באמצעות ערכת תיוג וזיהוי DIG DNA
    1. לערבב 3 מיקרוגרם של הבדיקה עם מים לנפח סופי של 15 μl.
    2. לפגל את ה- DNA על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולצנן במהירות על קרח.
    3. הוסף 2 μl של 10x תערובת hexanucleotide, 2 μl של תמהיל dNTP תיוג, וμl 1 של אנזים Klenow 15 μl של ה- DNA מפוגל.
    4. לערבב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות עד 48 שעות ולעצור תגובה על ידי חימום על 65 מעלות צלזיוס.
  3. בדוק את הרגישות של הבדיקה שכותרת DIG באמצעות ערכת תיוג וזיהוי DIG DNA
    1. ידני 1 טען μl של דילולים סדרתי של חללית הבקרה החיובית המסופקים בערכה וng 1 של החללית שכותרת DIG על קרום הניילון ויבש במשך 5 דקות על RT.
    2. בקצרה להשרות את הקרום במאגר 2x SSC (0.3 M NaCl, 30 נתרן ציטרט מ"מ, pH 7.0) ו דגירה הקרום על 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי לשתק את ה- DNA.
    3. בקצרה להשרות את הקרום במאגר חומצת maleic (MAB, 0.1 מ 'חומצת maleic, 0.15 מ' NaCl, pH 7.5) ו דגירה עם אנטי DIG phosphatase (AP) נוגדן -conjugated המדולל בסיסי (1: 5,000) ב 6 מיליליטר של תמיסת חסימה סיפק בערכה ב RT למשך 30 דקות.
    4. לשטוף את הממברנה עם MABT (MAB המכיל 1% Tween 20) ולהחיל 40 μl של פתרון NBT / BCIP מעורב עם חיץ 2 מיליליטר זיהוי (0.1 מ 'טריס HCl, 0.1 מ' NaCl, 0.05 M MgCl 2, pH 9.5) על גבי קרום 1 דקות. אם את הרגישות של הבדיקה שכותרתו היאאינו מספק, חזור על שלבים מ1.1.3 ל1.3.4.
    5. מדוד את ריכוז ה- DNA של החללית שכותרתו (OD260) ולהתאים את הריכוז עד 100 ng μl -1.
  4. בדקו את הספציפיות של הבדיקה שכותרת DIG
    1. לפגל דגימות הדנ"א הגנומי (25 ng 3 μl -1 לכל דגימה) ממיני חיידקים שונים, כוללים החיידק הממוקד על ידי הבדיקה הספציפית, על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולצנן במהירות על קרח.
    2. ידני לטעון את ה- DNA מפוגל על ​​קרום הניילון ויבש במשך 20 דקות ב RT.
    3. בקצרה להשרות את הקרום במאגר 2x SSC ודגירת הקרום על 80 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי לשתק את ה- DNA.
    4. חסום את הממברנה עם פתרון חסימה ב RT עבור שעה 1.
    5. לדלל את הבדיקה בng 1 μl -1 במאגר הכלאה, לפגל בדיקות מדוללים, ולהחיל על הממברנה.
    6. דגירה הקרום ב 45 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    7. לשטוף את הממברנה שלושפעמים עם חיץ 2x SSC.
    8. בקצרה להשרות את הקרום בMAB.
    9. דגירה עם הנוגדן אנטי DIG AP-מצומדות המדולל (1: 2,000) ב 6 מיליליטר של פתרון חסימה ב RT עבור שעה 1.
    10. לשטוף את הממברנה עם MABT ולהחיל 40 μl של פתרון NBT / BCIP מעורב עם חיץ זיהוי 2 מיליליטר.
    11. כאשר הבדיקה אינה משיגה את הספציפיות הצפויות, להגדיל את טמפרטורת ההכלאה עד הסגוליות הוא ציין.

2. הכלאה באתר

שים לב: כדי למנוע ייבוש של הדגימות וחומרים כימיים, לבצע את כל incubations בתא humidified המרופד במגבות נייר רטובות.

  1. דה-paraffinization והתייבשות של חלקי רקמות
    1. הכן 4 מיקרומטר סעיפי רקמות עבים מלוקים מוטבעים פרפין. פורמלין, paraformaldehyde, ומקבעים מבוסס אבץ בקנה אחד עם פרוטוקול זה.
    2. הכן את כל חומרים כימיים במי DEPC שטופל.
    3. שקופיות חום בתנור יבש ב 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ודגירת שקופיות ב RT למשך 30 דקות.
    4. לטבול את השקופיות בקסילן 100% במשך 5 דקות שלוש פעמים; להשתמש קסילן הטרי בכל פעם.
      הערה: האם הליך השעווה-דה זה במנדף כימי.
    5. לטבול את השקופיות באתנול 100% במשך 5 דקות פעמיים, תוך שימוש באתנול טרי בכל פעם, ורעננותם דגימות ב -90% סדרתי, 80% ופתרונות אתנול 70% במשך 5 דקות כל אחד.
    6. לטבול את השקופיות במי DEPC שטופל דקות 1 ולשטוף שקופיות בPBS (pH 7.4) DEPC שטופל במשך 6 דקות.
  2. Pretreatments של סעיפי רקמות
    1. לטבול את השקופיות ב 0.1 N חומצה הידרוכלורית עבור 20 דקות ולשטוף במי מגלשות DEPC שטופל למשך 30 שניות.
    2. לצייר מחסום הידרופובי סביב דגימות באמצעות עט שעווה.
      הערה: הגודל של המחסום הידרופובי תלוי בגודל של דגימות. לכן, הכרכים של חומרים כימיים המשמשים בשלבים הבאים משתנים בהתאם לגודלו של דגימות אבל צריכים למלא הי"דמחסום drophobic (50 μl לדגימות קטנות וμl 400 לדגימות גדולות).
    3. פנק את הדגימות עם 50-400 μl של proteinase K (1 עד 10 מיליליטר מיקרוגרם -1 בPBS DEPC שטופל) בתנור יבש על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולשטוף בשקופיות PBS 1x DEPC שטופל דקות 1.
    4. משרים שקופיות בparaformaldehyde 4% ב- ​​PBS DEPC שטופל במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף בשקופיות PBS DEPC שטופל דקות 1.
    5. משרים שקופיות ב 0.1 M triethanolamine-HCl (pH 8.0) המכיל 0.5% אנהידריד אצטית עבור 20 דקות ולשטוף במי מגלשות DEPC שטופל למשך 30 שניות.
  3. הכלאה עם בדיקה ושטיפה
    1. לטבול את השקופיות במאגר SSC 2x במשך 20 דקות.
    2. לדלל את הבדיקה בng 1 μl -1 במאגר הכלאה (4x SSC, 50% [כרך / כרך] פוראמיד, הפתרון של 1x Denhardt, 10% [כרך WT /] סולפט dextran, 0.1% [כרך WT /] נתרן גופרתי dodecyl, 0.4 מיליליטר מ"ג -1 DNA זרע סלמון). עבור פקדים שליליים, לערבב את החללית שכותרתו עםסכום עודף של פי 10 מבדיקה שכותרתו שאינה.
    3. לפגל הבדיקות מדוללים ולהחיל 50-400 μl על סעיפי רקמות. במקום להחליק כיסוי בשקופית וחותם עם לק.
    4. שקופיות חום בPCR מכונה על 90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומגלשות דגירה בO תא humidified / N ב 45 ° C או בטמפרטורה אופטימלית נקבעו בצעד 1.4.11.
    5. לקרר את השקופיות על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, להסיר את המכסה מחליק, לטבול את השקופיות במאגר SSC סידורי כמו הדברים הבאים: 4x SSC במשך 10 דקות, (45 ° C) 2x SSC מראש התחמם במשך 20 דקות, 2x SSC במשך 10 דקות, ו0.2X SSC במשך 10 דקות.
  4. זיהוי עם נוגדן אנטי DIG AP-מצומדות
    1. לשטוף שקופיות בMABT במשך 5 דקות.
    2. לחסום עם 50-400 μl של חסימת פתרון עם 1% Tween 20 במשך 20 דקות.
    3. להוסיף 50-400 μl של נוגדן אנטי DIG-AP מדולל חסימת פתרון (1: 1000) anld לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות.
    4. לשטוף שקופיות בMABT במשך 10 דקות.
      5. <li> לטבול שקופיות במאגר זיהוי המכיל 1% Tween 20 במשך 5 דקות.
    5. פנק עם 50-400 μ של levamisole 1 מ"מ (במאגר זיהוי המכיל 1% Tween 20) במשך 5 דקות כדי להשבית phosphatase אלקליין אנדוגני.
    6. להפיץ 50-400 μl של הפתרון המעורבב מראש NBT / BCIP (בדילול במאגר זיהוי בשעה 1: 100) על כל דגימה ודגירת שקופיות בתא humidified ב RT עבור 2 עד 3 שעות עד האות פיתחה היא משביעת רצון.
    7. יש לשטוף את שקופיות עם מים מיוננים להפסיק הדמיה ולהחיל 50-400 μl של 0.05% [כרך WT /] ירוק מתיל ככתם דלפק על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    8. יש לשטוף את שקופיות עם מים מיוננים, ליבש באתנול 100%, ולטבול בקסילן.
    9. החל 80 μl של פתרון הרכבה על כל שקופית ולכסות עם מכסה מחליק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מופעי איור 1 dot סופג של בדיקות שכותרת DIG לעומת הבדיקה הבקרה החיובית המסופקת בערכה כדי לקבוע את רגישותם. 343 נ"ב פ הבדיקה -specific gingivalis היא 25 פעמים יותר רגישה מבדיקת eubacterial 70 נ"ב. איור 2 מראה הכלאה באתר של רקמות חניכיים המתקבלות מחולים עם מחלת חניכיים כרוניות לגילוי של פ gingivalis וeubacteria. אותות החיידקים, מוצגים בסגול, התגלו בתוך epithelia, propria lamina, וbiofilm הממוקם מחוץ לרקמה. עם זאת, חלוקת פ gingivalis וeubacteria בתוך רקמת החניכיים היה שונה. בהגדלה גבוהה (1,000X), צורות שונות (coccus, מוט, כישורי, וצורת שעיר) של חיידקים היו גלויים באמצעות הבדיקה eubacterial, בעוד חיידקים בצורת מוט רק התגלו על ידי פ הבדיקה -specific gingivalis. צורות מפוזרות של אותות חיידקיםגם נצפו.

Hajishengallis et al. הוכיח את התפקיד החיוני של חיידקי commensal בפיתוח של פ gingivalis -induced חניכיים ניסיוניות בעכברים 14. היישום של נתרן גופרתי dextran (DSS), צומת הדוקה (TJ) כימי -disrupting, על חניכיים חניכיים נגרמות רירית ואובדן עצם מכתשיים בעכברים 13. הבדיקה eubacterial זוהתה בהצלחה חיידקים בתוך רקמות החניכיים מקבוצת DSS שלא זוהו על ידי פ הבדיקה gingivalis -specific (איור 3).

הבדיקה eubacterial שימושית לחקר המעורבות הפוטנציאלית של חיידקים במחלות אחרות. מאז הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן המיועד הליקובקטר פילורי ככיתה אני מסרטן לסרטן קיבה 15, מעורבות אפשרית של חיידקים בפיתוח סוגי הסרטן אחרים נחקרה באופן נרחב. כאשר sections של ביופסיות ריאה מאובחנת עם קרצינומה של תאי קשקש היה באתר הכלאה עם הבדיקה eubacterial, החיידקים התגלו גם בתוך התאים הסרטניים ובין סטרומה שמסביב / חדירת תאים (איור 4). הכלאה באתר באמצעות הבדיקה eubacterial גם היה מוחלים לחקור את הנוכחות של חיידקים בנגעים של יכן פלנוס האוראלי, מחלה חיסונית דלקתית עם אטיולוגיה לא ידועה. מעניין לציין, אותות חיידקים התגלו לא רק בepithelia אלא גם בpropria lamina בי חדירה כמו להקה נצפתה. בהגדלה גבוהה, אותות החיידקים התגלו בגרעינים של תאים רבים (איור 5).

איור 1
איור 1. מבחן רגישות לבדיקות שכותרת DIG. בדיקות שכותרת מותאמות אישית בדילול סדרתי וcontr חיוביהבדיקה ol המסופקת בערכה היו מחקה נקודה עם נוגדן אנטי DIG-AP-מצומדות. לאחר הוספת המצע, הכתם עם פ הבדיקה -specific gingivalis פותחה במשך 30 שניות, בעוד הכתם עם חללית eubacterial פותח דקות 1. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. איתור של חיידקים בתוך רקמות חניכיים המתקבלים מחולים עם מחלת חניכיים כרוניות. סעיפים של ביופסיות חניכיים מהאתר הבריא () והאתר החולה (ב) למטופל עם מחלת חניכיים היו נתונים לhematoxylin-eosin (H & E) מכתים או הכלאה באתר עם ​​או פ בדיקה gingivalis -specific או הבדיקה eubacterial. Negativבקרות אלקטרוניים היו הכלאה עם הבדיקה מעורבבת עם בדיקה ללא תווית עודפת של פי 10. האזור המוגדל מצויינים עם תיבה מרובעת. אותות חיוביים נציג, שמוצגים בסגול, מסומנים בחצים דקים. חיצים עבים מצביעים biofilm שלט מחוץ לרקמה. Biofilm השלט בחן בהגדלה 1,000X מוצג בריבועים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. איתור של חיידקי commensal אוראליים בתוך רקמת החניכיים של עכבר. מיסב ניסויי היה מושרה בעכברים / ג BALB על ידי חיסון אוראלי של פ gingivalis (PG) או יישום של DSS על רירית חניכיים. חלקי חניכיים מעכברים היו נתונים לצביעת H & E או הכלאה באתר עם ​​או < em> P. בדיקה gingivalis -specific או הבדיקה eubacterial. אותות חיוביים נציג, שמוצגים בסגול, מסומנים בחיצים. הגדלה מקורית היא X400. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. איתור של חיידקים בתוך נגע סרטני. הסעיפים של ביופסיות ריאה מחולים שאובחנו עם קרצינומה של תאי קשקש היה מוכתמים עם H & E או באתר הכלאה עם או הבדיקה eubacterial האוניברסלית או הבדיקה ביקורת השלילית. האזור המוגדל מצויינים עם תיבה מרובעת. אותות חיוביים נציג, שמוצגים בסגול, מסומנים בחיצים. גבול של תאים סרטניים מסומנים בקווים מקווקווים.arget = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. איתור של חיידקים בתוך הנגעים של יכן פלנוס האוראלי. הסעיפים של ביופסיה מרירית לחי אובחנה כיכן פלנוס האוראלי היו מוכתמים עם H & E או באתר הכלאה עם או הבדיקה eubacterial האוניברסלית או הבדיקה ביקורת השלילית. האזורים מוגדלים מצוינים עם תיבה מרובעת. אותות חיוביים נציג, שמוצגים בסגול, מסומנים בחיצים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הנה פרוטוקול למקם חיידקים בתוך רקמות מוטבעים פרפין באמצעות בדיקה DNA שכותרת DIG תואר. הבדיקה מתמקדת במולקולות ה- DNA או RNA של גן 16S rRNA חיידקים, ויכולות להיות מתוכננות בדיקות 16S rRNA המיקוד כמו גם מינים ספציפיים או אוניוורסלי. הכלאה מסוימת של פ הבדיקה -specific gingivalis לפ gingivalis אבל לא לחיידקים אוראליים אחרים כבר הראה בעבר 10. לעומת זאת, הבדיקה eubacterial הכלאה לכל DNA החיידקים הגנומי שנבדק (17 מינים שונים), למרות שיעילות הכלאה מגוונת 12. מספר T-נוקלאוטידים בתוך החללית קובע את היעילות של DIG-תיוג. ייצור של חללית שכותרת DIG עם רגישות גבוהה הוא השלב הקריטי ביותר ליישום המוצלח של הפרוטוקול המתואר. טיפול בדגימות עם חומצה הידרוכלורית משפרת את יחס אות לרעש במוצא של חלבונים וhydrolysi החלקיים של רצפי יעד. עלייה בריכוז של proteinase K מגבירה נגישות היעד של בדיקות אך מפחיתה שימור רקמות. לכן, מומלץ לבדוק כמה ריכוזים של proteinase K, בהתאם לסוגים של רקמות. צעד acetylation יורד רקע מחייב של חללית מטען השלילית לחלבונים של הרקמה על ידי acetylating קבוצות אמינו הטעון חיובי. לאחר שורה של צעדי ההכנה הללו, קטעי הרקמה לקרוע בקלות, ובכך, צריכים לטפל בם בזהירות. רקע הוא מינימאלי בהשוואה לדגים. עם זאת, האותות מרקמות עם פעילות phosphatase גבוהה אנדוגני בסיסי כגון עצמות ובלוטות ריר יש לפרש באופן ביקורתי.

בדיקות דנ"א מוגברות-PCR הן קלה לייצר ויציבים בהשוואה לבדיקות RNA. גילוי immunohistochemical של בדיקות הכלאה מאפשר זיהוי של מבנים היסטולוגית באמצעות השוואה עם סעיפי H & E מוכתמות: epithelia,רקמת חיבור, מחלחל דלקתי, וכלי דם הם גם מכובדים. אחת המגבלות של הפרוטוקול המתואר הוא חוסר היכולת ליישם בדיקות מרובות באותו הזמן. בנוסף, ההרחקה של האותות מזיהום חיידקים על פני השטח של חלקים מוגבלת.

פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי לזהות תעתיקי חיידקים אחרים בתוך סעיפי רקמות 16. בנוסף, פרוטוקול זה יכול להתארך עד להכפיל צביעה עם גילוי immunohistochemical של סמן תא מארח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענק (2013R1A1A3005669) מקרן המחקר הלאומית של קוריאה ומענק (HI13C0016) של בריאות הטכנולוגיה מו"פ פרויקט, משרד הבריאות והרווחה הקוריאני.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic anhydride Sigma 6404
50% Dextran sulfate solution Millipore S4030
50X Denhardt’s solution Sigma D2532
DEPC Sigma P159220
DIG DNA labeling and detection kit Roche 11 093 657 910
Formamide Sigma F9037
ImmEdge™ Pen Dako H-400
Levamisole Vector SP-5000
Magnesium chloride Sigma 246964
Maleic acid Sigma M0375
Methyl green Sigma M6776
Paraformaldehyde Sigma P1648
Permount Fisher SP15-500
Salmon sperm DNA solution Invitrogen #15632-011
Sodium chloride Sigma S9625
Sodium citrate Duksan D1420
Sodium dodecyl sulfate Amresco 227
Triethanolamine-HCl Sigma 90279
Tris-HCl Research organics 3098T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis. J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).
  2. Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).
  3. Saglie, F. R., et al. The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria. J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).
  4. Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies. J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).
  5. Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva. J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).
  6. Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
  7. Marttila, E., et al. Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis. J. Oral Microbiol. 6, (2014).
  8. Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization. J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).
  9. Abrams, K., Caton, J., Polson, A. Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding. J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).
  10. Kim, Y. C., et al. Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis. Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).
  11. Choi, Y. S., et al. Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers. Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).
  12. Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions. J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).
  13. Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).
  14. Hajishengallis, G., et al. A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
  15. Axon, A. Gastric cancer and Helicobacter pylori. Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).
  16. Fenhalls, G., et al. In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions. Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).

Tags

אימונולוגיה גיליון 99 פריודונטיה מיקרוביולוגיה האוראלית, 16S rRNA חיידקים רקמות מוטבעות פרפין מינים ספציפיים אוניוורסלי
<em>באתרו</em> איתור של חיידקים בתוך רקמות מוטבעות-פרפין באמצעות DNA בדיקה שכותרת Digoxin מיקוד 16S rRNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K.… More

Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836, doi:10.3791/52836 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter