قياس معدلات المبيدات الأيض في Dicot الأعشاب مع الفحص رفعه ليف
Summary
This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.
Abstract
In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and –sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.
Introduction
مقاومة مبيدات الأعشاب في الأعشاب الضارة يشكل تهديدا خطيرا للإنتاج العالمي من المواد الغذائية والألياف 1،2. حاليا، الآلاف من السكان مقاومة وbiotypes من أكثر من مائة أنواع الأعشاب في جميع أنحاء العالم وقد تم توثيق ودراسة 3. آلية الكبرى التي تمنح مقاومة مبيدات الأعشاب في النباتات هي تغيير مبيدات الأعشاب الجينات والبروتينات الموقع المستهدف، بما في ذلك الطفرات الوراثية التي تؤثر على حركية ملزمة مبيدات الأعشاب البروتين أو التضخيم من الجينات الموقع المستهدف 2. إزالة السموم الأيضية عبر الأنشطة مرتفعة من أكسيجيناز أحادية السيتوكروم P450 (P450) أو الجلوتاثيون S -transferase (GST) الإنزيمات هو آلية أخرى الذي يمنح مقاومة مبيدات الأعشاب في الأعشاب الضارة، والذي يختلف بعدة طرق من الآليات القائمة على الموقع المستهدف-2. المقاومة القائم على التمثيل الغذائي لها تداعيات كبيرة على ما إذا كانت تكاليف اللياقة البدنية النبات (ويعرف أيضا باسم عقوبات اللياقة البدنية) قد تنجم عن mechanis مبيدات الأعشاب المقاومةم، وكذلك بشأن احتمال وجود آلية إزالة السموم واحدة للتشاور المقاومة العابرة أو متعددة مبيدات الأعشاب في السكان الاعشاب 1،2،4. عموما، يمكن تقسيم عملية التمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب في النباتات إلى ثلاث مراحل متميزة 5. وتشمل المرحلة الأولى تحويل مبيدات الأعشاب أو تفعيل مثل الهيدروكسيل P450 بوساطة من الحلقات العطرية أو مجموعات الألكيل، أو N – أو ردود فعل dealkylation O-، مما يؤدي إلى زيادة الاستقطاب ومبيدات الأعشاب الجزئي إزالة السموم 5،6. أدخلت حديثا المجموعات الوظيفية في المرحلة الأولى يمكن أن توفر مواقع الربط لاقتران إلى انخفاض الجلوتاثيون التي كتبها GSTs أو إلى جلوكوز عن طريق glycosyltransferases UDP التي تعتمد في المرحلة الثانية 5،7. على سبيل المثال، والأيض الأولي الرئيسي للprimisulfuron-الميثيل في الذرة هو هيدروكسي primisulfuron ميثيل 8، والتي يمكن استقلاب أيضا على هيدروكسي primisulfuron-جلوكوسيدي (المرحلة الثانية) ومن ثم نقلها إلى فجوة للتخزين طويل الأجل أو زيادة الأيض المؤيدcessing 5،6 (المرحلة الثالثة).
Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) هي التي يصعب السيطرة عليها، dicot الأنواع السنوية الاعشاب التي تعيق إنتاج الذرة (ذرة شامية) وفول الصويا (جليكاين ماكس)، والقطن (الكرسف أزغب) في الولايات المتحدة. ومما يسهل على درجة عالية من التنوع الجيني للwaterhemp التي لها البيولوجيا ثنائي الجنس والمسافات الطويلة تلقيح الرياح، ومحطة waterhemp أنثى واحدة يمكن أن تنتج ما يصل إلى مليون البذور 9. هذه البذور صغيرة وتنتشر بسهولة، والتي تمنح بشكل طبيعي waterhemp مع آلية تشتت فعالة. Waterhemp يعرض إنبات مستمرة طوال موسم النمو 9، وبذوره قادرة على الإنبات بعد عدة سنوات من السكون. Waterhemp هو نبات C 4 التي تمتلك معدل نمو أعلى من معظم الأعشاب ذات الأوراق العريضة في النظم الزراعية الصالحة للزراعة 10. بالإضافة إلى ذلك، العديد من السكان waterhemp مقاومة لفام متعددةilies مبيدات الأعشاب 3.
عدد سكانها waterhemp (المعين MCR) عن ولاية إلينوي مقاوم لل4-هيدروكسي-فينيل بيروفات دي أكسيجيناز (HPPD) -inhibiting مبيدات الأعشاب 11، مثل mesotrione، فضلا عن الأترازين وسينسيز acetolactate (ALS) -inhibiting مبيدات الأعشاب، بما في ذلك primisulfuron ميثيل ، نظرا لعدم استهداف الموقع الآليات القائمة 12،13. عدد السكان مختلفة من waterhemp المعينة ACR 14، وهو primisulfuron مقاومة للالميثيل (بسبب طفرة في جين ALS)، ولكن حساسية لmesotrione مقاومة للالأترازين، ويبلغ عدد سكانها waterhemp المعينة WCS 14 التي تعتبر حساسة لprimisulfuron ميثيل، استخدمت mesotrione، والأترازين بالمقارنة مع MCR في بحث سابق لدينا 12 والتجارب الحالية (ملخصة في الجدول 1). لم الدراسات الأولية لم يكشف تغييرات في مستويات التسلسل الجيني HPPD أو التعبير، أو انخفاض امتصاص mesotrione، في MCRالسكان بالمقارنة مع السكان الحساسة mesotrione 12. ومع ذلك، دراسات التمثيل الغذائي مع النباتات الكاملة أظهروا مستويات أقل بكثير من mesotrione الأم مبيدات الأعشاب في MCR مقارنة مع ACR وWCS، التي ترتبط مع ردود المظهري السابقة لmesotrione 11،12.
| Waterhemp السكان | الاختصار | النمط الظاهري لMesotrione | آلية Mesotrione المقاومة | النمط الظاهري لPrimisulfuron | آلية Primisulfuron المقاومة |
| ماكلين مقاطعة مقاومة لل | MCR | مقاوم | التمثيل الغذائي* | مقاوم | التمثيل الغذائي |
| آدامز مقاطعة مقاومة لل | ACR | Sensitإيف | – | مقاوم | طفرة في الموقع المستهدف في ALS 14 |
| مقاطعة وين-حساس | WCS | حساس | – | حساس | – |
* آليات المقاومة غير المستهدفة الموقع، بخلاف تعزيز عملية التمثيل الغذائي، ويمكن أيضا أن تمنح المقاومة mesotrione في عدد السكان MCR 12.
الجدول 1: وصف السكان waterhemp عن ولاية إلينوي المستخدمة في هذه الدراسة.
بالإضافة إلى تحديد معدلات الأيض مبيدات الأعشاب في الشتلات waterhemp سليمة، تم وضع المنهج التجريبي مختلفة ويعملون في بحثنا السابق للتحقيق في عملية التمثيل الغذائي باستخدام waterhemp رفعه ورقة فحص 12 فضلا عن مختلف مثبطات P450 (على سبيل المثال، tetcyclacis والملاثيون). وقد تم تكييف هذه الطريقة على وجه التحديد لwaterhemp من PREVIالتحقيق الأوس الأيض-primisulfuron الميثيل في الذرة رفعه يترك 15، منذ لم يتم إبلاغ ورقة فحص المستأصل لإجراء البحوث الأيض مبيدات الأعشاب في مصنع dicot. تم الحشرات الملاثيون organophophosate كثيرا ما تستخدم في الجسم الحي في المختبر البحوث مبيدات الأعشاب الأيض تشير إلى تورط P450 16. على سبيل المثال، والتسامح، والتمثيل الغذائي السريع لmesotrione في الذرة ومن المقرر أن P450 المحفزة الهيدروكسيل الحلبة، والتي تم التحقق عندما الملاثيون زيادة الحساسية الذرة إلى mesotrione 17. وبالمثل، تحول دون الملاثيون التمثيل الغذائي للALS المانع primisulfuron-الميثيل في الذرة رفعه يترك 15. والميزة الرئيسية لهذه التقنية ورقة رفعه هو أن البيانات التي تم إنشاؤها مستقلة عن أنماط النبات كامل النبات، عاملا هاما في الاعتبار عند تقييم التمثيل الغذائي للالنظامية ومبيدات الأعشاب مبيد في النباتات. ونتيجة لذلك، وهذا الأسلوب يسمح الكمي ويحلل التمثيل الغذائي النوعي للتركيز على ورقة واحدة تعالج 12.
استراتيجية استنساخ الخضري، في تركيبة مع بروتوكول رقة المستأصل، استخدمت سابقا في waterhemp لإجراء دراسات عملية التمثيل الغذائي 12. ونظرا لطبيعة التهجين من waterhemp (منفصلة للذكور والإناث النباتات)، ودرجة كبيرة من التنوع الجيني داخل الأنواع Amaranthus ثنائي الجنس 9، يضمن هذا البروتوكول الذي تم تحليل الشتلات waterhemp وراثيا متطابقة ضمن التجارب وقتا بالطبع. توضح هذه المقالة الأداة المساعدة للأسلوب ورقة رفعه لقياس معدلات التمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب في الأعشاب الضارة dicot (waterhemp). تم تحديد كمية المبيدات الأم تبقى في كل نقطة زمنية (الشكل 1) من غير الخطية أقل التحليل الساحات الانحدار، وكان مناسبا مع منحنى الدرجة الأولى بسيطة لتقدير الوقت ل50٪ من مبيدات الأعشاب استيعابها لتتحلل ( DT 50). ممثليتم عرض الاستشرابية من عكس المرحلة العالية الاداء اللوني السائل (RP-HPLC) للALS-المقاومة والسكان waterhemp -sensitive، التي تشير إلى اختفاء مبيدات الأعشاب الأم وتشكيل يصاحب ذلك من المستقلب القطبي (الصورة) خلال دراسة وقتا بالطبع (الشكل 2). محور مقالنا هو وصف وإثبات فائدة من ورقة فحص المستأصل في تركيبة مع طريقة الاستنساخ النباتي لتحديد معدلات دقيقة وقابلة للتكرار في استقلاب مبيدات الأعشاب في محطات dicot، وذلك باستخدام بشكل موحد وصفت حلقة (URL- 14 C) مبيدات الأعشاب في ثلاثة السكان waterhemp التي تختلف في ردود كامل مصنع لHPPD- ومبيدات الأعشاب تثبيط ALS (الجدول 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة رفعه ورقة الموصوفة هنا تم استخدامها سابقا في البحث الأيض primisulfuron في الذرة يترك 15، ولكن تظهر نتائجنا أن هذا البروتوكول هو أيضا فعالة ودقيقة، وقابلة للتكرار لقياس التمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب في أنواع الأعشاب dicot 12. والميزة الرئيسية لهذه التقنية ور…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
| Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
| Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
| HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
| Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
| Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
| Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 mL tubes |
| Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 mL tubes |
| Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 mL, sterile |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
| Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
| High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
| Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
| Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
| Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
| Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
| Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |
Riferimenti
- Yu, Q., Powles, S. Metabolism-based herbicide resistance and cross-resistance in crop weeds: A threat to herbicide sustainability and global crop production. Plant Physiology. 166, 1106-1118 (2014).
- Powles, S. B., Yu, Q. Evolution in action: plants resistant to herbicides. Annual Reviews in Plant Biology. 61, 317-347 (2010).
- Heap, I., et al. Global perspective of herbicide-resistant weeds. Pest Management Science. 70 (9), 1306-1315 (2014).
- Délye, C., et al. Non-target-site-based resistance should be the centre of attention for herbicide resistance research: Alopecurus myosuroides as an illustration. Weed Research. 51 (5), 433-437 (2011).
- Kreuz, K., Tommasini, R., Martinoia, E. Old enzymes for a new job. Herbicide detoxification in plants. Plant Physiology. 111, 349-353 (1996).
- Riechers, D. E., Kreuz, K., Zhang, Q. Detoxification without intoxication: herbicide safeners activate plant defense gene expression. Plant Physiology. 153, 3-13 (2010).
- Siminszky, B. Plant cytochrome P450-mediated herbicide metabolism. Phytochemistry Reviews. 5 (2-3), 445-458 (2006).
- Fonné-Pfister, R., et al. Hydroxylation of primisulfuron by an inducible cytochrome P450-dependent monooxygenase system from maize. Pesticide Biochemistry and Physiology. 37 (2), 165-173 (1990).
- Steckel, L. E. The dioecious Amaranthus spp.: here to stay. Weed Technology. 21 (2), 567-570 (2007).
- Horak, M. J., Loughin, T. M. Growth analysis of four Amaranthus species. Weed Science. 48 (3), 347-355 (2000).
- Hausman, N. E., et al. Resistance to HPPD-inhibiting herbicides in a population of waterhemp (Amaranthus tuberculatus) from Illinois, United States. Pest Management Science. 67 (3), 258-261 (2011).
- Ma, R., et al. Distinct detoxification mechanisms confer resistance to mesotrione and atrazine in a population of waterhemp. Plant Physiology. 163, 363-377 (2013).
- Guo, J., et al. Non-target-site resistance to ALS inhibitors in waterhemp (Amaranthus tuberculatus). Weed Science. in press, (2015).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. A waterhemp (Amaranthus tuberculatus) biotype with multiple resistance across three herbicide sites of action. Weed Science. 53 (1), 30-36 (2005).
- Kreuz, K., Fonné-Pfister, R. Herbicide-insecticide interaction in maize: malathion inhibits cytochrome P450-dependent primisulfuron metabolism. Pesticide Biochemistry and Physiology. 43 (3), 232-240 (1992).
- Correia, M. A., Ortiz de Montellano, P. R., Ortiz de Montellano, P. R. . Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry. , 247-322 (2005).
- Hawkes, T. R., et al. Mesotrione: mechanism of herbicidal activity and selectivity in corn. Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference – Weeds. 2, 563-568 (2001).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. Variable herbicide responses among Illinois waterhemp (Amaranthus rudis and A. tuberculatus) populations. Crop Protection. 21 (9), 707-712 (2002).
- Jalaludin, A., Yu, Q., Powles, S. B. Multiple resistance across glufosinate, glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicides in an Eleusine indica population. Weed Research. 55 (1), 82-89 (2015).
- Iwakami, S., et al. Cytochrome P450 CYP81A12 and CYP81A21 are associated with resistance to two acetolactate synthase inhibitors in Echinochloa phyllopogon. Plant Physiology. 165, 618-629 (2014).
