Bir kesilmiş yaprak Testi ile Dikot Weeds Herbisit Metabolizma düşük Ölçme
Summary
This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.
Abstract
In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and –sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.
Introduction
Otların herbisit direnci gıda ve lif 1,2 küresel üretim ciddi bir tehdit sunuyor. Şu anda yüzden fazla ot türünden dayanıklı nüfus ve biyotipten dünya çapında binlerce belgelenmiş ve 3 çalışılmıştır. Bitkilerde herbisit dayanıklılığı veren önemli bir mekanizma, herbisite protein bağlama kinetikleri veya hedef site gen 2 amplifikasyonu etkileyen genetik mutasyonlar da dahil olmak üzere herbisit hedef sitesi genler ve proteinler, değişikliktir. Sitokrom P450 monooksigenazı (P450) ya da glutation S -Transferase (GST) enzimlerin yüksek aktiviteleri ile metabolik detoksifikasyon hedef alan bazlı mekanizmalar 2 çeşitli şekillerde farklı olan bir yabani ot herbisid direnci kazandıran bir mekanizmadır. Metabolik tabanlı direnç (spor cezaları aka) bitki spor maliyetleri herbisit dayanıklılığı mekaniği kaynaklanabilecek olup önemli etkileri vardırm, hem de yabani popülasyonları 1,2,4 bölgesindeki çapraz veya birden fazla herbisit direnci vermek için, tek bir detoksifikasyon mekanizması potansiyeli açısından. Genel olarak, bitkilere herbisid metabolizması üç ayrı 5 ayrılabilir. Artan polarite ve kısmi herbisit detoksifikasyon 5,6 giden ya da O-dealkilasyon reaksiyonları – Faz I Bu aromatik halkaların ya da alkil gruplarının P450 aracılı hidroksilasyon, ya da N ile olduğu gibi, herbisit veya değiştiren aktivasyonunu içermektedir. Yeni ben GST'lerin azaltılmış glutatyon konjugasyon için bağlantı siteleri sağlayabilir veya Faz II 5,7 UDP-bağımlı glikosiltransferazların tarafından glikoza Faz fonksiyonel gruplar tanıttı. Örneğin, mısırda primisulfuron-metil baştaki metaboliti hidroksi-primisulfuron-glukosite (Phase II) ve daha sonra metabolize uzun süreli depolama ya da daha fazla metabolik için vaküole nakledilebilir hidroksi-primisulfuron-metil 8, olduğu profesyonelcessing 5,6 (Phase III).
Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) Birleşik Devletler mısır üretimini (Zea mays), soya fasulyesi (Glycine max) ve pamuk (Gossypium hirsutum) engelleyen bir zor kontrol, dikot yıllık yabancı ot türüdür. Waterhemp genetik çeşitliliğin yüksek derecede onun ikievcikli biyolojisi ve uzun mesafe rüzgar tozlaşma ile kolaylaştırılır ve bir tek kadın waterhemp bitki milyon tohumlar 9 kadar üretebilir. Bu tohumlar doğal olarak etkili bir dağılma mekanizmasına sahip waterhemp bağışlamak, hangi küçük ve kolayca yayılırlar. Waterhemp büyüyen sezon 9 boyunca sürekli çimlenme görüntüler ve tohumları uyuşukluk birkaç yıl sonra filizlenmeye edebiliyoruz. Waterhemp ekilebilir kırpma sistemlerinde 10 en geniş yapraklı yabancı otların daha yüksek büyüme oranını sahip bir C 4 bitkidir. Ayrıca, çok sayıda waterhemp popülasyonları birden fam dayanıklıdırherbisit 3 ilies.
Illinois waterhemp (MCR adlandırılır) popülasyonu 4-hidroksi-fenilpiruvat dioksigenaz (HPPD) bu tür mezotrion olarak inhibe edici herbisitler 11, hem de atrazin ve asetolaktat sintazı (ALS) için, herbisit inhibe edici primisulfuron-metil içeren dayanıklı , hedef dışı site bazlı mekanizmalar 12,13 nedeniyle. Ve atrazin dirençli ancak mezotrion duyarlı ve primisülfüron-metil duyarlıdır DTH 14 olarak adlandırılan bir waterhemp popülasyon (nedeniyle ALS geninin mutasyona) primisülfüron-metil-dirençli ACR 14 belirlenen waterhemp farklı bir popülasyon, mezotrion ve atrazin, bizim daha önceki araştırmalar 12 ve mevcut deneylerde MCR ile karşılaştırıldığında kullanıldı (Tablo 1 'de özetlenmiştir). İlk çalışmalar MCR içinde, HPPD gen dizisi veya ifade düzeylerinde değişikliklere, veya azaltılmış mezotrion alımını tespit etmediNüfus zaman mezotrion duyarlı nüfus 12 ile karşılaştırıldığında. Ancak, bütün bitkilerle metabolizma çalışmaları 11,12 mezotrion önceki fenotipik yanıtları ile ilişkili ACR ve WCS ile karşılaştırıldığında MCR ebeveyn mezotrion herbisit anlamlı derecede düşük düzeylerde gösterdi.
| Waterhemp Nüfus | Kısaltma | Mezotrion için Fenotip | Mezotrion Direnç Mekanizması | Primisülfüron için Fenotip | Primisülfüron Direnç Mekanizması |
| McLean İlçe Dayanıklı | MCR | Dayanıklı | Metabolizma * | Dayanıklı | Metabolizma |
| Adams County Dayanıklı | ACR | Sensitive | – | Dayanıklı | ALS 14 Hedef site mutasyonu |
| Wayne County Duyarlı | WCS | Duyarlı | – | Duyarlı | – |
* Geliştirilmiş metabolizma dışında hedef olmayan site direnç mekanizmaları, aynı zamanda MCR nüfus 12 mezotrion direnci kazandırabilmektedir.
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan Illinois'den waterhemp popülasyonlarının tanımlanması.
Sağlam waterhemp fide herbisid metabolizması hızlarının belirlenmesine ek olarak, farklı deneysel yaklaşım geliştirilmiştir ve kesilmiş waterhemp yaprak tahlil 12 yanı sıra çeşitli P450 inhibitörlerinin (ör tetcyclacis malathion) kullanarak, metabolizmayı incelemek için önceki çalışmada kullanılan. Bu yöntem, bir önceki yaklaşımlardan waterhemp için özel olarak uyarlanmıştıreksize yaprak tahlili henüz bir dikot bitkide herbisit metabolizması araştırma için rapor edilmemiştir beri eksize mısırda primisulfuron-metil metabolizması lı soruşturma, 15 bırakır. Organophophosate insektisit malation sıklıkla in vivo kullanılmıştır ve in vitro herbisite metabolizması araştırma P450 tutulumu 16 gösterir. Örneğin, tolerans ve mısırdaki mezotrion ve hızlı metabolizma malation mezotrion 17 mısır duyarlılığı arttıkça doğrulanmıştır P450 katalizlenen halka hidroksilasyon, kaynaklanmaktadır. Benzer şekilde, malation kesilmiş mısır ALS inhibitörü primisulfuron-metil 15 yaprak metabolizmasını inhibe etti. Bitkilerde sistemik olarak, topraktan çıkma herbisidlerin metabolizmasını değerlendirirken eksize yaprak tekniğin önemli bir avantajı, üretilen veriler bütün bitki translokasyon desen bağımsız olmasıdır, önemli bir faktör dikkate. Sonuç olarak, bu yöntem, niceliksel izin verir veNitel metabolik tedavi edilen tek bir yaprak 12 odaklanmak analizleri.
Bir bitkisel klonlama stratejisi, eksize yaprak protokolü ile kombinasyon halinde, daha önce metabolizma çalışmaları 12 yapmak için waterhemp da kullanılmıştır. Nedeniyle waterhemp (ayrı erkek ve dişi bitkiler) ve ikievcikli amaranthus türlerinin 9 içindeki genetik çeşitliliğin büyük derecesi outcross doğası gereği, bu protokol genetik özdeş waterhemp fidanları zaman ders deneyler içinde analiz edildi sağlanmalıdır. Bu makalede, bir dikot ot (waterhemp) herbisid metabolizmasının oranlarını ölçmek için kesilmiş yaprak yöntemin kullanımını göstermektedir. Ana yabani ot öldürücü miktarı, (absorbe herbisitin% 50 indirgeme için zaman tahmin etmek için basit bir birinci dereceden eğrisi ile uygun olan doğrusal olmayan en küçük kareler regresyon analizi ile her bir zaman noktasında (Şekil 1) belirlendi ve geri kalan DT 50). Temsilciters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP-HPLC) ile ilgili kromatogramlar karşı ALS ve zaman-akışı çalışma sırasında ana yabani ot öldürücü ve kutupsal metabolit (ler) eşlik eden oluşumuyla kaybolması göstermektedir -duyarlı waterhemp popülasyonları (Şekil için gösterildi 2). Bizim derlemenin konusu düzgün olarak bir halka etiketli (URL- 14 ° C) herbisit kullanarak, tarif ve dikot bitkilerdeki herbisid metabolizmasının yeniden üretilebilir ve kesin hızını belirlemek için bitkisel klonlama yöntemi ile kombinasyon halinde kesilmiş yaprak testinin kullanılmasını göstermek için bunların bütün bitki yanıtlarında farklı üç waterhemp popülasyonları HPPD- ve ALS engelleyici herbisitler (Tablo 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tarif edilen kesilmiş yaprak yöntemi, mısır yaprak 15 içinde primisülfüron metabolizma araştırma, daha önce kullanılmış olan, ancak sonuçlar, bu protokol, aynı zamanda, bir dikot zararlı bitki türleri 12 herbisid metabolizmasını ölçmek için, etkili, uygun ve tekrarlanabilir olduğunu göstermektedir. Bütün bitki çalışmalarla karşılaştırıldığında kesilmiş yaprak tekniğin önemli bir avantajı, bir kesilmiş yaprak bütün bitki translokasyon toprak yüzeyi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
| Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
| Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
| HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
| Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
| Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
| Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 mL tubes |
| Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 mL tubes |
| Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 mL, sterile |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
| Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
| High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
| Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
| Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
| Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
| Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
| Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |
Riferimenti
- Yu, Q., Powles, S. Metabolism-based herbicide resistance and cross-resistance in crop weeds: A threat to herbicide sustainability and global crop production. Plant Physiology. 166, 1106-1118 (2014).
- Powles, S. B., Yu, Q. Evolution in action: plants resistant to herbicides. Annual Reviews in Plant Biology. 61, 317-347 (2010).
- Heap, I., et al. Global perspective of herbicide-resistant weeds. Pest Management Science. 70 (9), 1306-1315 (2014).
- Délye, C., et al. Non-target-site-based resistance should be the centre of attention for herbicide resistance research: Alopecurus myosuroides as an illustration. Weed Research. 51 (5), 433-437 (2011).
- Kreuz, K., Tommasini, R., Martinoia, E. Old enzymes for a new job. Herbicide detoxification in plants. Plant Physiology. 111, 349-353 (1996).
- Riechers, D. E., Kreuz, K., Zhang, Q. Detoxification without intoxication: herbicide safeners activate plant defense gene expression. Plant Physiology. 153, 3-13 (2010).
- Siminszky, B. Plant cytochrome P450-mediated herbicide metabolism. Phytochemistry Reviews. 5 (2-3), 445-458 (2006).
- Fonné-Pfister, R., et al. Hydroxylation of primisulfuron by an inducible cytochrome P450-dependent monooxygenase system from maize. Pesticide Biochemistry and Physiology. 37 (2), 165-173 (1990).
- Steckel, L. E. The dioecious Amaranthus spp.: here to stay. Weed Technology. 21 (2), 567-570 (2007).
- Horak, M. J., Loughin, T. M. Growth analysis of four Amaranthus species. Weed Science. 48 (3), 347-355 (2000).
- Hausman, N. E., et al. Resistance to HPPD-inhibiting herbicides in a population of waterhemp (Amaranthus tuberculatus) from Illinois, United States. Pest Management Science. 67 (3), 258-261 (2011).
- Ma, R., et al. Distinct detoxification mechanisms confer resistance to mesotrione and atrazine in a population of waterhemp. Plant Physiology. 163, 363-377 (2013).
- Guo, J., et al. Non-target-site resistance to ALS inhibitors in waterhemp (Amaranthus tuberculatus). Weed Science. in press, (2015).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. A waterhemp (Amaranthus tuberculatus) biotype with multiple resistance across three herbicide sites of action. Weed Science. 53 (1), 30-36 (2005).
- Kreuz, K., Fonné-Pfister, R. Herbicide-insecticide interaction in maize: malathion inhibits cytochrome P450-dependent primisulfuron metabolism. Pesticide Biochemistry and Physiology. 43 (3), 232-240 (1992).
- Correia, M. A., Ortiz de Montellano, P. R., Ortiz de Montellano, P. R. . Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry. , 247-322 (2005).
- Hawkes, T. R., et al. Mesotrione: mechanism of herbicidal activity and selectivity in corn. Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference – Weeds. 2, 563-568 (2001).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. Variable herbicide responses among Illinois waterhemp (Amaranthus rudis and A. tuberculatus) populations. Crop Protection. 21 (9), 707-712 (2002).
- Jalaludin, A., Yu, Q., Powles, S. B. Multiple resistance across glufosinate, glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicides in an Eleusine indica population. Weed Research. 55 (1), 82-89 (2015).
- Iwakami, S., et al. Cytochrome P450 CYP81A12 and CYP81A21 are associated with resistance to two acetolactate synthase inhibitors in Echinochloa phyllopogon. Plant Physiology. 165, 618-629 (2014).
