מדידת מחירים של קוטל העשבים מטבוליזם בעשבי Dicot עם Assay נכרת עלה
Summary
This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.
Abstract
In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and –sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.
Introduction
התנגדות קוטל עשבים בעשבים מהווה איום רציני לייצור העולמי של 1,2 מזון והסיבים. נכון לעכשיו, אלפי אוכלוסיות וbiotypes עמידות מלמעלה ממאה מיני עשבים בעולם תועדו ולמד 3. מנגנון עיקרי שמקנה עמידות קוטל עשבים בצמחים הוא השינוי של גני קוטל עשבים יעד אתר וחלבונים, כוללים מוטציות גנטיות המשפיעות על קינטיקה מחייבת קוטל עשבים-חלבון או הגברה של גן מטרת אתר 2. ניקוי רעלים מטבוליים באמצעות פעילות מוגברת של monooxygenase ציטוכרום P450 (P450) או אנזימי -transferase S גלוטתיון (GST) הוא מנגנון אחר שמקנה עמידות קוטל עשבים בעשבים, שהוא נבדל במספר דרכים ממנגנונים מבוססי יעד אתר 2. יש התנגדות מבוססת חילוף חומרים השלכות משמעותיות עבור האם עלויות כושר צמח (aka עונשי כושר) יכולות לנבוע מmechanis קוטל עשבים-ההתנגדותמ ', כמו גם לגבי הפוטנציאל למנגנון ניקוי רעלים יחיד להקנות עמידות צולבת או מרובה-קוטל עשבים באוכלוסיות עשב 1,2,4. בדרך כלל, חילוף חומרים קוטלי עשבים בצמחים יכולים להיות מחולק לשלושה שלבים ברורים 5. שלב I כרוך המרת קוטל עשבים או הפעלה כגון hydroxylation תיווך P450 של טבעות ריחניות או קבוצות אלקיל, או על ידי N – או תגובות dealkylation O-, שהוביל לקוטביות גדלה ועשבים חלקיים גמילה 5,6. חדש הציג קבוצות פונקציונליות בשלב שאני יכול לספק אתרי הצמדה לנטייה לגלוטתיון מופחת על ידי GSTs או לגלוקוז על ידי glycosyltransferases UDP תלוי בשלב II 5,7. לדוגמא, המטבוליט הראשוני העיקרי של primisulfuron-מתיל בתירס הוא הידרוקסי-מתיל-primisulfuron 8, שבו ניתן מטבוליזם נוסף להידרוקסי-primisulfuron-glucoside (Phase II) ולאחר מכן הועבר לvacuole לאחסון לטווח ארוך או חילוף חומרים נוספים פרוcessing 5,6 (Phase III).
Waterhemp (tuberculatus Amaranthus) הוא מין קשה לשליטה, dicot שנתי עשב שמעכב את הייצור של תירס (Zea Mays), סויה (מקסימום גליצין), וכותנה (Gossypium hirsutum) בארצות הברית. הרמה הגבוהה של מגוון הגנטי של waterhemp היא הקלה על ידי האבקת רוח הביולוגיה dioecious ומרחקים ארוכים שלה, וצמח waterhemp נקבה אחת יכול לייצר עד מיליון זרעים 9. זרעים אלה הם קטנים ולהתפשט בקלות, אשר באופן טבעי להעניק waterhemp עם מנגנון פיזור יעיל. Waterhemp מציג נביטה רציפה לאורך כל עונת גידול 9, וזרעיו יכולים לנבוט לאחר מספר שנים של תרדמת. Waterhemp הוא צמח C 4 שבעל שיעור צמיחה גבוה מרוב עשבי broadleaf במערכות חיתוך לעיבוד 10. בנוסף, אוכלוסיות waterhemp רבות עמידים בפני Fam מרובהilies של קוטלי עשבים 3.
אוכלוסייה של waterhemp (מיועד MCR) מאילינוי היא עמידה ל4-הידרוקסי-phenylpyruvate dioxygenase (HPPD) קוטלי עשבים -inhibiting 11, כגון mesotrione, כמו גם לאטרזין וsynthase acetolactate (ALS) -inhibiting קוטלי עשבים, כולל primisulfuron-מתיל , בשל מנגנונים מבוססים היעד הלא-אתר 12,13. אוכלוסייה שונה של waterhemp המיועדת 14 ACR, שהוא primisulfuron-מתיל-עמיד (עקב מוטציה בגן ALS) ואטרזין עמיד אבל רגיש לmesotrione, ואוכלוסיית waterhemp המיועדת 14 WCS שהוא רגיש לprimisulfuron-מתיל, mesotrione, ואטרזין שמשו בהשוואה לMCR במחקר שלנו לפני 12 וניסויים הנוכחיים (מסוכם בטבלה 1). מחקרים ראשוניים לא לזהות שינויים ברמות רצף גן HPPD או ביטוי, או ספיגת mesotrione מופחתת, בMCRאוכלוסייה בהשוואה לאוכלוסיות mesotrione רגישה 12. עם זאת, מחקרי חילוף חומרים עם כל צמחים הפגינו רמות נמוכות יותר באופן משמעותי של קוטל העשבים mesotrione ההורה בMCR לעומת ACR וWCS, אשר מתואם עם תגובות פנוטיפי קודמות לmesotrione 11,12.
| Waterhemp אוכלוסייה | קיצור | הפנוטיפ לMesotrione | מנגנון Mesotrione התנגדות | הפנוטיפ לPrimisulfuron | מנגנון Primisulfuron התנגדות |
| מקלין קאונטי-עמיד | MCR | עמיד | חילוף חומרים * | עמיד | חילוף חומרים |
| אדמס קאונטי-עמיד | ACR | Sensitאייב | – | עמיד | מוטציה יעד אתר ב -14 ALS |
| וויין קאונטי-רגיש | WCS | רגיש | – | רגיש | – |
* מנגנונים ללא יעד אתר התנגדות, מלבד חילוף חומרים משופרים, עשויים גם להעניק התנגדות mesotrione באוכלוסיית MCR 12.
טבלת 1: תיאור של אוכלוסיות waterhemp מאילינוי השתמשו במחקר זה.
בנוסף לקביעת תעריפים של חילוף חומרים קוטלי עשבים בשתילי waterhemp שלמים, גישה ניסויית שונה פותחה ומועסק במחקר הקודם שלנו כדי לחקור את חילוף החומרים באמצעות assay נכרת waterhemp עלה 12 כמו גם מעכבי P450 שונים (לדוגמא, tetcyclacis ומלתיון). שיטה זו הותאמה במיוחד עבור waterhemp מpreviחקירת היחידות הארגוניות של חילוף חומרים primisulfuron-מתיל בתירס נכרת משאירה 15, מאז assay העלה נכרת עדיין לא דווח לביצוע מחקר חילוף חומרים קוטלי עשבים במפעל dicot. מלתיון החרקים organophophosate כבר משמש לעתים קרובות לin vivo ובמחקר קוטל עשבים-חילוף חומרים מבחנה כדי לציין את מעורבות P450 16. לדוגמא, סובלנות וחילוף חומרים מהירים של mesotrione בתירס נובעים hydroxylation טבעת זרז-P450, אשר אומת כאשר מלתיון רגישות מוגברת לתירס mesotrione 17. באופן דומה, מלתיון עכבות חילוף חומרים של מעכב primisulfuron-מתיל ALS בתירס נכרת משאיר 15. יתרון עיקרי של טכניקת העלה נכרתה הוא שהנתונים שנוצרו אינם תלויים בדפוסי טרנסלוקציה-שלם צמח, גורם חשוב להביא בחשבון כאשר בוחנים את חילוף החומרים של קוטלי עשבים מערכתיים, postemergence בצמחים. כתוצאה מכך, שיטה זו מאפשרת כמותיים וחילוף חומרים איכותיים מנתחים להתמקד בעלה טופל יחיד 12.
אסטרטגית שיבוט וגטטיבי, בשילוב עם פרוטוקול העלה הניכר, נוצלה בעבר בwaterhemp לבצע מחקרי חילוף חומרים 12. בשל אופי outcrossing של waterhemp (זכר נפרד וצמחי נקבה), ומידה רבה של שונות גנטיות בתוך מיני Amaranthus dioecious 9, פרוטוקול זה הבטיח כי שתילי waterhemp גנטי זהים נותחו בניסויים בזמן הקורס. מאמר זה מדגים את התועלת של שיטת העלה נכרת למדידת שיעורים של חילוף חומרים קוטלי עשבים בעשב dicot (waterhemp). כמות העשבים הורה שנותרה הייתה נחוש בכל נקודת זמן (איור 1) על ידי ניתוח רגרסיה ריבועים לפחות שאינו ליניארי, והייתה בכושר עם עקומה מסדר הראשון פשוט כדי להעריך את הזמן עבור 50% מקוטלי עשבים נקלטו להשפיל ( DT 50). נציגchromatograms מכרומטוגרפיה הפוך-שלב ביצועים גבוהים נוזלית (RP-HPLC) מוצגים לALS עמיד ואוכלוסיות waterhemp -sensitive, המצביעות על היעלמותו של קוטל עשבים הורה והיווצרות נלווית של המטבוליט קוטבי (ים) במהלך מחקר בזמן קורס (איור 2). המוקד של המאמר שלנו הוא לתאר ולהדגים את התועלת של assay העלה נכרת בשילוב עם שיטת שיבוט וגטטיבי לקביעת שיעורים מדויקים ושחזור של חילוף חומרים קוטלי עשבים בצמחי dicot, באמצעות קוטלי עשבים באופן אחיד שכותרתו טבעת (14 URL- C) ב שלוש אוכלוסיות waterhemp שונות בתגובות-הצמח כולם לHPPD- וקוטלי עשבים עיכוב ALS (טבלת 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה נכרת העלים המתוארים במסמך זה נעשתה שימוש בעבר במחקר חילוף החומרים primisulfuron בתירס משאיר 15, אבל התוצאות שלנו מראות כי בפרוטוקול זה הוא גם יעיל, מדויק, ושחזור למדידת חילוף חומרים קוטלי עשבים במיני עשבי dicot 12. יתרון עיקרי של טכניקת העלה נכרתה בהשוואה למחק?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
| Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
| Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
| HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
| Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
| Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
| Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 mL tubes |
| Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 mL tubes |
| Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 mL, sterile |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
| Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
| High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
| Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
| Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
| Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
| Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
| Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |
Riferimenti
- Yu, Q., Powles, S. Metabolism-based herbicide resistance and cross-resistance in crop weeds: A threat to herbicide sustainability and global crop production. Plant Physiology. 166, 1106-1118 (2014).
- Powles, S. B., Yu, Q. Evolution in action: plants resistant to herbicides. Annual Reviews in Plant Biology. 61, 317-347 (2010).
- Heap, I., et al. Global perspective of herbicide-resistant weeds. Pest Management Science. 70 (9), 1306-1315 (2014).
- Délye, C., et al. Non-target-site-based resistance should be the centre of attention for herbicide resistance research: Alopecurus myosuroides as an illustration. Weed Research. 51 (5), 433-437 (2011).
- Kreuz, K., Tommasini, R., Martinoia, E. Old enzymes for a new job. Herbicide detoxification in plants. Plant Physiology. 111, 349-353 (1996).
- Riechers, D. E., Kreuz, K., Zhang, Q. Detoxification without intoxication: herbicide safeners activate plant defense gene expression. Plant Physiology. 153, 3-13 (2010).
- Siminszky, B. Plant cytochrome P450-mediated herbicide metabolism. Phytochemistry Reviews. 5 (2-3), 445-458 (2006).
- Fonné-Pfister, R., et al. Hydroxylation of primisulfuron by an inducible cytochrome P450-dependent monooxygenase system from maize. Pesticide Biochemistry and Physiology. 37 (2), 165-173 (1990).
- Steckel, L. E. The dioecious Amaranthus spp.: here to stay. Weed Technology. 21 (2), 567-570 (2007).
- Horak, M. J., Loughin, T. M. Growth analysis of four Amaranthus species. Weed Science. 48 (3), 347-355 (2000).
- Hausman, N. E., et al. Resistance to HPPD-inhibiting herbicides in a population of waterhemp (Amaranthus tuberculatus) from Illinois, United States. Pest Management Science. 67 (3), 258-261 (2011).
- Ma, R., et al. Distinct detoxification mechanisms confer resistance to mesotrione and atrazine in a population of waterhemp. Plant Physiology. 163, 363-377 (2013).
- Guo, J., et al. Non-target-site resistance to ALS inhibitors in waterhemp (Amaranthus tuberculatus). Weed Science. in press, (2015).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. A waterhemp (Amaranthus tuberculatus) biotype with multiple resistance across three herbicide sites of action. Weed Science. 53 (1), 30-36 (2005).
- Kreuz, K., Fonné-Pfister, R. Herbicide-insecticide interaction in maize: malathion inhibits cytochrome P450-dependent primisulfuron metabolism. Pesticide Biochemistry and Physiology. 43 (3), 232-240 (1992).
- Correia, M. A., Ortiz de Montellano, P. R., Ortiz de Montellano, P. R. . Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry. , 247-322 (2005).
- Hawkes, T. R., et al. Mesotrione: mechanism of herbicidal activity and selectivity in corn. Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference – Weeds. 2, 563-568 (2001).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. Variable herbicide responses among Illinois waterhemp (Amaranthus rudis and A. tuberculatus) populations. Crop Protection. 21 (9), 707-712 (2002).
- Jalaludin, A., Yu, Q., Powles, S. B. Multiple resistance across glufosinate, glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicides in an Eleusine indica population. Weed Research. 55 (1), 82-89 (2015).
- Iwakami, S., et al. Cytochrome P450 CYP81A12 and CYP81A21 are associated with resistance to two acetolactate synthase inhibitors in Echinochloa phyllopogon. Plant Physiology. 165, 618-629 (2014).
