Misurare Tassi di erbicida Metabolismo in Dicot Erbacce con un saggio asportati Foglia
Summary
This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.
Abstract
In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and –sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.
Introduction
Resistenza agli erbicidi in erbacce presenta una grave minaccia per la produzione mondiale di cibo e fibre 1,2. Attualmente, migliaia di popolazioni e biotipi resistenti provenienti da oltre un centinaio di specie infestanti in tutto il mondo sono stati documentati e studiati 3. Un meccanismo importante che conferisce resistenza agli erbicidi nelle piante è l'alterazione di erbicidi geni e proteine bersaglio del sito, tra cui le mutazioni genetiche che colpiscono erbicida di proteine cinetica vincolanti o l'amplificazione del target loco gene 2. Disintossicazione metabolica attraverso attività elevati di citocromo P450 monoossigenasi (P450) o glutatione S -transferase (GST) enzimi è un altro meccanismo che conferisce resistenza agli erbicidi in piante infestanti, che è distinto in diversi modi dai meccanismi bersaglio posto a base 2. Resistenza a base metabolica ha ramificazioni significative per se i costi dell'impianto di fitness (aka sanzioni fitness) possono derivare dalle mechanis erbicidi resistenzam, nonché per quanto riguarda il potenziale di un singolo meccanismo di disintossicazione per conferire resistenza incrociata o multiplo erbicidi nelle popolazioni infestanti 1,2,4. Generalmente, il metabolismo erbicidi nelle piante può essere suddiviso in tre fasi distinte 5. Fase I implica la conversione erbicidi o l'attivazione come idrossilazione P450-mediata di anelli aromatici o gruppi alchilici, o da N – o reazioni dealchilazione O-, con conseguente aumento di polarità e erbicida parziale disintossicazione 5,6. Recentemente introdotto gruppi funzionali in fase I in grado di fornire i siti di collegamento per la coniugazione di glutatione ridotto da GST o di glucosio da parte glicosiltransferasi UDP-dipendenti in fase II 5,7. Ad esempio, il principale metabolita iniziale di primisulfuron-metile in mais è idrossi-primisulfuron-metil 8, che può essere ulteriormente metabolizzato a idrossi-primisulfuron-glucoside (Fase II) e poi trasportato al vacuolo per l'archiviazione a lungo termine o ulteriori metabolica professionistaelaborazione 5,6 (fase III).
Tuberculatus (Amaranthus tuberculatus) è un difficile da controllare, dicotiledoni specie infestanti annuali che ostacola la produzione di mais (Zea mays), soia (Glycine max), e cotone (Gossypium hirsutum) negli Stati Uniti. L'elevato grado di diversità genetica delle tuberculatus è facilitata dalla sua biologia dioica e lunga distanza l'impollinazione vento, e un singolo impianto tuberculatus femmina può produrre fino a un milione di semi 9. Questi semi sono piccoli e facilmente diffondersi, che naturalmente dotare tuberculatus con un meccanismo di dispersione efficace. Tuberculatus mostra la germinazione continua per tutta la stagione di crescita 9, ei suoi semi sono in grado di germinare dopo diversi anni di dormienza. Tuberculatus è una pianta C 4 che possiede un tasso di crescita superiore alla maggior parte infestanti a foglia larga nei sistemi a seminativo 10. Inoltre, numerose popolazioni tuberculatus sono resistenti alla fam multiplailies di erbicidi 3.
Una popolazione di tuberculatus (designato MCR) da Illinois è resistente 4-idrossi-phenylpyruvate diossigenasi (HPPD) erbicidi -inhibiting 11, come mesotrione, nonché atrazina e acetolattato sintetasi (ALS) -inhibiting erbicidi, compresi primisulfuron-metil , a causa della non-bersaglio-site meccanismi basati 12,13. Una diversa popolazione di tuberculatus designato ACR 14, che è primisulfuron-metil-resistenti (a causa di una mutazione nel gene ALS) e atrazina resistente ma sensibile al mesotrione, e una popolazione tuberculatus designato WCS 14 che è sensibile alla primisulfuron-metile, mesotrione, atrazina e sono stati utilizzati in confronto con MCR nella nostra ricerca anteriore 12 ed esperimenti correnti (riassunti nella Tabella 1). Gli studi iniziali non hanno rilevato alterazioni nei livelli di sequenza genica HPPD o di espressione, o ridotto mesotrione captazione, nel MCRpopolazione se confrontato con le popolazioni mesotrione sensibili 12. Tuttavia, studi sul metabolismo con piante intere dimostrato significativamente più bassi di mesotrione genitore erbicidi in MCR rispetto al ACR e WCS, che correlata con le risposte fenotipiche precedenti per mesotrione 11,12.
| Tuberculatus Popolazione | Abbreviazione | Fenotipo a Mesotrione | Resistenza mesotrione Meccanismo | Fenotipo a primisulfuron | Resistenza primisulfuron Meccanismo |
| McLean County-resistente | MCR | Resistente | Metabolismo * | Resistente | Metabolismo |
| Adams County-resistente | ACR | Sensitive | – | Resistente | Obiettivo-site mutazione in SLA 14 |
| Wayne County-Sensitive | WCS | Delicato | – | Delicato | – |
* Meccanismi di resistenza non-bersaglio-site, diversi metabolismo potenziato, può anche conferire resistenza mesotrione nella popolazione MCR 12.
Tabella 1: Descrizione delle popolazioni tuberculatus da Illinois utilizzati in questo studio.
Oltre a determinare i tassi di metabolismo erbicida piantine tuberculatus intatti, un approccio sperimentale diverso è stato sviluppato e impiegato nella nostra precedente ricerca per indagare il metabolismo utilizzando un tuberculatus asportato foglia saggio 12, nonché vari inibitori P450 (ad esempio, tetcyclacis e malathion). Questo metodo è stato adattato appositamente per tuberculatus da un previinvestigazione unità organizzative del metabolismo primisulfuron-metile in mais asportato lascia 15, dal momento che il test foglia asportato non era ancora stata segnalata per condurre ricerche metabolismo diserbante in un impianto dicot. L'insetticida malathion organophophosate è stato spesso utilizzato per in vivo e in vitro, la ricerca erbicidi metabolismo per indicare il coinvolgimento P450 16. Per esempio, la tolleranza e rapido metabolismo del mesotrione nel mais sono dovuti a idrossilazione anello P450-catalizzata, che è stata verificata quando malathion maggiore sensibilità mais mesotrione 17. Allo stesso modo, malathion inibito il metabolismo della SLA inibitore primisulfuron-metile in mais asportato lascia 15. Un importante vantaggio della tecnica foglio asportato è che i dati generati sono indipendenti modelli traslocazione intero impianto, un fattore importante da considerare quando si valuta metabolismo sistemico, erbicidi postemergence nelle piante. Di conseguenza, questo metodo consente quantitativa emetabolica analisi qualitative di concentrarsi su una singola foglia trattata 12.
Una strategia di clonazione vegetativa, in combinazione con il protocollo foglio asportato, è stato precedentemente utilizzato in tuberculatus condurre studi sul metabolismo 12. A causa della natura outcrossing di tuberculatus (separati per uomini e piante femminili), e alto grado di diversità genetica all'interno delle specie dioica Amaranthus 9, questo protocollo ha assicurato che piantine tuberculatus geneticamente identici sono stati analizzati entro gli esperimenti time-corso. Questo articolo illustra l'utilità del metodo di foglia asportato per misurare i tassi di metabolismo erbicidi in una pianta infestante dicot (tuberculatus). La quantità di erbicida genitore restante è stato determinato in ogni momento (Figura 1) da almeno analisi di regressione non lineare, e si forma con una curva semplice primo ordine per stimare il tempo per il 50% di erbicidi assorbita a degradare ( DT 50). Rappresentantecromatogrammi di fase inversa cromatografia liquida ad alta prestazione (RP-HPLC) vengono visualizzati per la SLA-resistenti e delle popolazioni tuberculatus sensitive, che indicano la scomparsa di erbicidi genitore e formazione concomitante del metabolita polare (s) nel corso di un periodo di studio-corso (Figura 2). Il focus del nostro articolo è quello di descrivere e dimostrare l'utilità del test foglia asportato in combinazione con un metodo di clonazione vegetativo per determinare i tassi di precise e riproducibili del metabolismo erbicidi nelle piante dicotiledoni, utilizzando uniformemente anello marcato (URL- 14 C) erbicidi tre popolazioni tuberculatus che si differenziano per le loro risposte integrali vegetali HPPD- e SLA-inibitori erbicidi (Tabella 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo espunto-foglia qui descritto è stato utilizzato in precedenza nella ricerca metabolismo primisulfuron nel mais lascia 15, ma i nostri risultati dimostrano che questo protocollo è anche efficace, preciso e riproducibile per misurare il metabolismo erbicidi in una specie infestanti dicotiledoni 12. Un importante vantaggio della tecnica foglio asportato rispetto studi intero impianto è che un foglio asportato è indipendente intero impianto modelli traslocazione di postemergence, erbicidi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
| Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
| Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
| HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
| Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
| Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
| Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 mL tubes |
| Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 mL tubes |
| Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 mL, sterile |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
| Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
| High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
| Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
| Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
| Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
| Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
| Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |
Riferimenti
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