摘出葉のアッセイで双子葉雑草除草剤代謝の速度を測定します
Summary
This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.
Abstract
In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and –sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.
Introduction
雑草除草剤抵抗性は食料や繊維1,2のグローバル生産に深刻な脅威を提示します。現在、世界中で百以上の雑草種から耐性個体群と生物型の何千もの文書化され、3を検討されています。植物に除草剤耐性を付与する主要なメカニズムは、ターゲットサイトの遺伝子2の除草剤-タンパク質結合動態または増幅に影響を与える遺伝子変異を含む除草剤の標的部位の遺伝子やタンパク質の変化です。シトクロムP450モノオキシゲナーゼ（P450）またはグルタチオン Sトランスフェラーゼ（GST）酵素の上昇活動を介した代謝解毒は、ターゲット・サイトベースのメカニズム2からいくつかの点で異なっているれ、雑草に除草剤耐性を付与する別のメカニズムです。代謝系の抵抗は（フィットネス罰則別名 ）植物の適応度コストは除草剤耐性mechanisから生じ得るかどうかに大きな影響を持っていますメートルだけでなく、雑草集団1,2,4におけるクロスまたは複数の除草剤耐性を付与するための単一の解毒メカニズムの可能性について。一般に、植物における除草剤の代謝は、3つの異なるフェーズ5に分割することができます。増加の極性と部分除草剤解毒5,6につながる、またはO-脱アルキル化反応-第I相は、芳香環またはアルキル基のP450媒介ヒドロキシル化、 または Nなどによる除草剤の変換や活性化を含みます。フェーズで新たに導入された官能基私のGSTによって還元型グルタチオンとの結合のための結合部位を提供することができますまたはフェーズII 5,7にUDP依存の糖転移酵素によってグルコースに。例えば、トウモロコシにおけるプリミスルフロンメチルの主要な初期の代謝物は、さらにヒドロキシプリミスルフロングルコシドする（フェーズII）を代謝して、長期保存またはさらなる代謝のための液胞に輸送することができるヒドロキシプリミスルフロンメチル8であり、プロcessing 5,6（フェーズIII）。
Waterhemp（ アマランサスのtuberculatus）は、米国で（ チョウ目害虫抵抗性ワタ ）難コントロールトウモロコシの生産（ トウモロコシ）を妨げ、双子葉植物の年間雑草種、大豆（ ダイズ ）、綿です。 waterhempの遺伝的多様性の高度は、雌雄異株の生物学と長距離風受粉によって促進され、1つの女性waterhemp工場は百万種子9まで生成することができます。これらの種子は、自然に効果的な分散機構をwaterhempを付与する、小型で容易に広がります。 Waterhempは生育期9を通して連続発芽が表示され、その種子は休眠の数年後に発芽することができます。 Waterhempは耕地作付体系10の中で最も広葉雑草よりも高い成長率を有しているC 4植物です。加えて、多数のwaterhemp集団は、複数のFAMに耐性であります除草剤3のilies。
イリノイ州からwaterhemp（MCR指定）の人口は、4-ヒドロキシフェニルピルジオキシゲナーゼ（HPPD）などメソトリオンなど-inhibiting除草剤11、だけでなく、アトラジン及びアセト乳酸合成酵素（ALS）に、除草剤を-inhibitingプリミスルフロンメチルを含むことに耐性があります、非標的サイトベースのメカニズム12,13に起因します。アトラジン耐性が、メソトリオンに敏感であり、プリミスルフロンメチルをに敏感である、WCS 14指定waterhemp人口（によるALS遺伝子の変異に）プリミスルフロンメチル抵抗性があるACR 14指定waterhempの異なる人口、メソトリオン、及びアトラジンは、事前の研究12と現在の実験におけるMCRとの比較に使用した（ 表1に要約 ）。初期の研究は、MCRに、HPPD遺伝子配列または発現レベル、または減少しメソトリオンの取り込みの変化を検出しませんでしたメソトリオンに敏感な集団12と比較して人口。しかし、植物全体での代謝試験は、11,12メソトリオンするために、前の表現型応答と相関ACRおよびWCS、と比較してMCRの親メソトリオンの除草剤の有意に低いレベルを示しました。
| Waterhemp人口 | 略語 | メソトリオンの表現型 | メソトリオン耐性機構 | プリミスルフロンの表現型 | プリミスルフロン抵抗性機構 |
| マクリーン郡耐性 | MCR | 耐性 | 代謝* | 耐性 | 代謝作用 |
| アダムズ郡耐性 | ACR | Sensitアイブ | – | 耐性 | ALS 14における標的部位の突然変異 |
| ウェイン郡感受性 | WCS | 敏感 | – | 敏感 | – |
*強化代謝以外の非標的部位の耐性機構は、また、MCR集団12メソトリオン耐性を付与することができます。
表1：本研究で用いたイリノイ州からwaterhemp集団の説明。
そのままwaterhemp苗に除草剤の代謝の速度を決定することに加えて、別の実験的なアプローチを切除waterhemp葉アッセイ12だけでなく、様々なP450 阻害剤（例えば、tetcyclacisとマラチオン）を使用して代謝を調査するために私たちのこれまでの研究で開発し、採用しました。この方法は、previからwaterhempのために特別に適応されました切除した葉のアッセイは、まだ双子葉植物に除草剤の代謝研究を行うために報告されていなかったため、切除したトウモロコシにおけるプリミスルフロンメチル代謝のOUの調査は、15を残します。 organophophosate殺虫剤マラチオンはしばしばP450の関与16を示すために 、インビボおよびインビトロ除草剤代謝研究に使用されてきました。例えば、トウモロコシにおける寛容とメソトリオンの急速な代謝がマラチオンがメソトリオン17にトウモロコシの感度を増加させた際に確認されたP450-触媒リングヒドロキシル化、によるものです。同様に、マラチオンは15を残し切除したトウモロコシにALS阻害プリミスルフロンメチルの代謝を阻害しました。切除した葉の技術の主な利点は、生成されたデータは、植物における全身、発芽後除草剤の代謝を評価する際に考慮すべき重要な要因全植物転パターンとは無関係であるということです。したがって、この方法は、定量可能と定性的な代謝は、単一の処理した葉12に注力して分析します。
栄養クローニング戦略は、切除された葉のプロトコルと組み合わせて、以前に代謝試験12を実施する waterhemp利用しました。他殖のwaterhemp（男女別の植物）の性質、および雌雄異株アマランサスの種内の遺伝的多様性の大幅9に、このプロトコルは、遺伝的に同一waterhempの苗は、時間経過実験内で分析されたことを確実にしました。この記事では、双子葉雑草（waterhemp）で除草剤代謝の速度を測定するための切除した葉の方法の有用性を示します。親の除草剤の量は、（吸収された除草剤の50％が分解する時間を推定するために、単純な一次曲線でフィッティングし、非線形最小二乗回帰分析によって、各時点（ 図1）で決定し、そして残りましたDT 50）。代表的な逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）のクロマトグラムは、親の除草剤及び経時試験中の極性代謝物（単数または複数）の同時形成（ 図の消失を示すALS耐性および感受性waterhemp集団のために表示されています2）。私たちの記事の焦点は中に均一にリング標識（URL-14 C）除草剤を使用し、説明し、双子葉植物における除草剤の代謝の正確で再現率を決定するための栄養クローニング法との組み合わせで切除された葉のアッセイの有用性を実証することです彼らの全体のプラントHPPD-への対応と、ALS阻害除草剤（ 表1）が異なる3 waterhemp集団。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書中に記載の切除した葉の方法は、トウモロコシが15を残すにプリミスルフロン代謝の研究で以前に使用されてきたが、我々の結果は、このプロトコルはまた、双子葉雑草種12に除草剤の代謝を測定するための、効果的かつ正確で再現性があることを示しています。全植物の研究と比較して、切除した葉の技術の主な利点は、切除された葉が発芽後の全植物転パターン?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
| Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
| Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
| HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
| Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
| Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
| Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 mL tubes |
| Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 mL tubes |
| Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 mL, sterile |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
| Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
| High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
| Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
| Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
| Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
| Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
| Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |
Riferimenti
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