절제 잎 분석과 쌍자엽 잡초의 제초제 대사의 요금을 측정

Summary

This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

Abstract

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and –sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.

Introduction

잡초의 제초제 저항은 식품 및 섬유 ^{1, 2의} 글로벌 생산에 심각한 위협을 선물한다. 현재 백 이상 잡초 종에 강한 집단과 생물 형의 수천 전 세계적으로 문서화하고 ³ 연구되고있다. 식물에 제초제 저항성을 부여하는 주요 메커니즘은 제초제 – 단백질 결합 반응 속도 또는 대상 사이트 유전자 ^2의 증폭에 영향을 미치는 유전 적 변이를 포함하는 제초제 대상 사이트 유전자와 단백질의 변경입니다. 시토크롬 P450 모노 옥 시게나 제 (P450) 또는 글루타치온 S의 -transferase (GST) 효소의 높은 활동을 통해 대사 해독 대상 현장 기반 메커니즘 ^2에서 여러 가지 방법으로 구분된다 잡초의 제초제 저항성을 부여하는 또 다른 메커니즘입니다. 대사 기반의 저항 (피트니스 처벌 일명) 공장 피트니스 비용은 제초제 저항 메커니즘 정보 발생할 수 있는지 여부에 대한 상당한 파급 효과를 가지고m뿐만 아니라 잡초 개체군 ^1,2,4에서 교차 또는 다중 제초제 내성을 부여하는 단일 해독 메커니즘 전위에. 일반적으로 식물에 제초제 대사는 세 가지 단계 ^5로 나눌 수 있습니다. 증가 극성 부분 제초제 해독 ^5,6로 이어지는, 또는 O- 탈 알킬화 반응 – 단계 I는 방향족 고리 또는 알킬 그룹의 P450 매개 수산화, 또는 N으로 같은 제초제 변환 또는 활성화를 포함한다. 새로 나는 GSTs 감소 글루타티온에 결합에 대한 링크 사이트를 제공 할 수 있습니다 또는 단계 II ^5,7에서 UDP에 의존하는 글리코에 의해 포도당 단계에 관능기를 도입했다. 예를 들어, 옥수수의 primisulfuron 메틸의 주요한 초기 대사 산물은 또한 하이드 록시 primisulfuron 글루코 내지 (단계 II)를 대사 후 장기간 저장 또는 상기 대사위한 액포로 이송 될 수 히드 록시 primisulfuron 메틸 ⁸ 인 찬성cessing ^5,6 (단계 III).

Waterhemp (Amaranthus의 tuberculatus)는 미국의 옥수수 생산 (ZEA이 메이), 콩 (글리신 최대), 면화을 (고십 피움 히르 수툼) 방해하기 어려운 제어, 쌍자엽 연간 잡초 종입니다. waterhemp의 유전 적 다양성의 높은 수준은 자웅 이주의 생물학 및 장거리 바람 수분에 의해 촉진되고, 하나의 여성 waterhemp 공장 만 씨앗 ⁹ 개까지 생성 할 수 있습니다. 이 씨는 자연스럽게 효과적인 분산 메커니즘 waterhemp을 부여하는, 작고 쉽게 확산됩니다. Waterhemp는 성장시기 ^(9)에 걸쳐 연속 발아를 표시하고, 그 씨앗은 휴면 몇 년 후 발아 할 수 있습니다. Waterhemp은 경작 할 작물 재배 시스템 ^{(10)에있는} 대부분의 잎이 넓은 잡초보다 더 높은 성장률을 가지고 C ₄ 식물입니다. 또한, 다수의 집단 waterhemp 여러 FAM에 내성제초제 ³ ilies.

일리노이 waterhemp (MCR)의 이용의 인구는 4- 히드 록시 phenylpyruvate 시게나 제 (HPPD) 예컨대 메소 트리 온 등 -inhibiting 제초제 ^(11)뿐만 아니라, 아트라진 및 아세토 락 테이트 신타 제 (ALS)에, 제초제 -inhibiting primisulfuron 메틸을 포함하는 내성 비 대상 현장 기반 메커니즘 ^{(12, 13)로} 인해. 와 아트라진에 강한하지만 메소 트리 온에 민감하고, primisulfuron 메틸을 민감 WCS ⁽¹⁴⁾ 지정된 waterhemp 인구 (때문에 ALS 유전자의 돌연변이에) primisulfuron 메틸 내성 ACR ⁽¹⁴⁾ 지정 waterhemp의 다른 인구, 메소 트리 온 및 아트라진가 우리의 이전 연구 ^12, 현재 실험 MCR와 비교 하였다 (표 1에 요약 하였다). 초기 연구는 MCR에, HPPD 유전자 서열 또는 발현 수준의 변화, 또는 감소 메소 트리 온의 흡수를 감지하지 않았다인구 때 메소 트리 온 민감한 인구 ^(12)와 비교. 그러나, 전체 식물 대사 연구는 ^{11, 12} 메소 이전 표현형의 반응과 상관 ACR과 WCS에 비해 MCR에서 부모 메소 트리 온 제초제의 상당히 낮은 수준을 보여 주었다.

Waterhemp 인구	약어	메소에 표현형	메소 트리 온 저항 메커니즘	Primisulfuron에 표현형	Primisulfuron 저항 메커니즘
맥린 카운티 저항하는	MCR	저항하는	대사 *	저항하는	대사
아담스 카운티 저항하는	ACR	Sensit필자	–	저항하는	ALS (14)에 대상 사이트 돌연변이
웨인 카운티에 민감한	WCS	민감한	–	민감한	–

* 향상된 대사 이외의 비 표적 사이트 저항 메커니즘은 또한 MCR 인구 ⁽¹²⁾ 메소 트리 온 저항을 부여 할 수있다.

표 1 : 본 연구에 사용 일리노이 waterhemp 개체군의 설명.

그대로 waterhemp 모종의 제초제 대사의 비율을 결정하는 것에 더하여, 다른 실험적 방법은 개발되었으며 절제 waterhemp 리프 세이 ^(12)뿐만 아니라 다양한 P450 억제제 (예 tetcyclacis 및 말라 티온)를 사용하여 대사를 조사하기 이전 연구에서 사용. 이 방법은 previ에서 waterhemp을 위해 특별히 적응했다적출 된 잎의 분석이 아직 쌍자엽 식물에 제초제 대사 연구를 수행보고되지 않은 때문에 절제 옥수수에 primisulfuron 메틸 대사의 OU를 조사, ^{15 나뭇잎.} organophophosate 살충제 말라 티온 자주 생체에 사용 된 체외 제초제 대사 연구에서 P450의 참여 ^(16)를 나타냅니다. 예를 들어, 관용과 옥수수에 메소 트리 온의 빠른 대사는 말라 티온은 메소 트리 온 ⁽¹⁷⁾ 옥수수 감도를 증가 할 때 확인되었다 P450 – 촉매 링 수산화,에 기인한다. 마찬가지로, 말라 티온은 절제 옥수수에서 루게릭 병 억제제 primisulfuron 메틸 ¹⁵ 잎의 신진 대사를 억제 하였다. 식물 조직, 출현 후 제초제의 대사를 평가할 때 적출 리프 기술의 주요 이점은, 생성 된 데이터는 전체 플랜트 전위 패턴 무관하다는 것이다, 중요한 요인을 고려한다. 따라서,이 방법은 정량 할 수 있으며질적 대사는 단일 처리 리프 ^(12)에 초점을 분석한다.

식물 클로닝 전략은 적출 리프 프로토콜과 함께, 이전에 대사 과정 ^(12)을 실시 waterhemp에 이용 하였다. 때문에 waterhemp (별도의 남성과 여성의 식물)과 자웅 이주 Amaranthus 종 ⁽⁹⁾ 내에서 유전 적 다양성의 큰 정도의 이종간 교배 특성으로,이 프로토콜은 유 전적으로 동일한 waterhemp 모종 시간 코스 실험에서 분석 하였다 것을 보장. 이 문서는 쌍자엽 잡초 (waterhemp)에서 제초제 신진 대사의 속도를 측정하기위한 절제 잎 방법의 유틸리티를 보여줍니다. 부모 제초제의 양 (흡수 된 제초제의 50 %가 저하하는 시간을 추정하기 위해 단순 일차 곡선 적합 하였다 비선형 최소 제곱 회귀 분석에 의해 각각의 시간 점 (도 1)에서 측정 한 한 나머지 DT _50). 대리인역상 고속 액체 크로마토 그래피 (RP-HPLC)에서 크로마토 내성 ALS-및 시간 과정 연구 중에 부모 제초제 및 극성 대사 산물 (들)의 병용 형성의 소실을 나타내는 과민 waterhemp 인구 (그림 표시되는 2). 우리 문서의 포커스가 균일 링 – 표지 (URL- ¹⁴ C) 제초제를 사용하여 설명하고 쌍자엽 식물 제초제 대사의 정확하고 재현 가능한 요금을 결정하기위한 식물 클로닝 방법과 조합 적출 리프 분석의 유용성을 입증하는 것이다 자신의 전체 식물의 반응에 차이가 세 waterhemp 인구는 HPPD-하고 루게릭 병 억제 제초제 (표 1).

Protocol

1. 식물 재료, 성장 조건, 그리고 식물 복제 참고 : 세 waterhemp 집단이 연구 조사 하였다 : MCR (아담스 카운티, 일리노이에서), ACR, 및 WCS (맥린 카운티, 일리노이에서) (표 1) (웨인 카운티, 일리노이에서). 수집하여 0.1 g L-1 한천 waterhemp 씨앗 일시 : 발아를 강화하기 위해 적어도 30 일 동안 4 ℃에서 용액을 물. 참고 : 일부 waterhemp 인구가 휴면 있지만,이 …

Representative Results

메소 트리 온 신진 대사의 속도에 큰 차이는 WCS 또는 ACR과 MCR (그림 1) 중 하나를 사이에 검출되었다. 각각의 시점에서, MCR은 더 빠른 속도로 이전의 전체 공장의 표현형 응답 (11)과 상관이 메소 트리 온 민감한 인구, WCS 및 ACR보다 메소 트리 온을 물질 대사로 변화했다. 각 집단에서 단일 부모의 공장에서 충분히 식물을 복제하여, 제초제 대사 시간 코스 분석에 의한마다 코스 <s…

Discussion

여기에 설명 된 절제 잎 방법은 옥수수가 ^{15 나뭇잎에} primisulfuron 대사 연구에서 이전에 사용되었지만, 우리의 결과는이 프로토콜은 또한 쌍자엽 잡초 종 ¹² 제초제 신진 대사를 측정하기위한 효과적인 정확하고 재현성이 있음을 입증. 전체 식물 연구에 비해 적출 잎 기술의 가장 큰 장점은 적출 잎은 전체 식물 전위의 출현 후 패턴, 전신 제초제 또는 식물 또는 인구 중 제초제 흡수…

Materials

Agar	Sigma-Aldrich	A1296	for pre-germinating seeds
Potting medium	Sun Gro Horticulture	49040233	for plant growth
Nutricote	Agrivert	TOTAL BLEND 13-13-13 T100	slow-release fertilizer
Growth chamber E15	Controlled Environments Limited	20207	plant culturing
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500	buffer for excised leaves
HCl (concentrated)	Fisher Scientific	A144500	adjust pH of buffer
Murashige and Skoog (MS) salts	Sigma-Aldrich	M0404	incubation of excised leaves
Methanol	Fisher Scientific	A452-4	leaf washes after incubation
Acetone	Sigma-Aldrich	179124	plant extractions
Acetonitrile (HPLC grade)	Macron Fine Chemicals	MKH07610	HPLC mobile phase
Formic acid	Mallinckrodt Analytical	MK259205	acidify mobile phase pH
Micro-centrifuge	Eppendorf	5417R	1.5 or 2.0 mL tubes
Centrifuge (temperature controlled)	Eppendorf	5810R	15 or 50 mL tubes
Polypropylene centrifuge tube	Corning Inc.	430790	15 mL, sterile
Rotary evaporator	BÜCHI	R200	concentrate plant samples
Liquid scintillation spectrometry (LSS)	Packard Instruments	104470	quantify 14C
High-performance liquid chromatography	Perkin Elmer	N2910401	resolve herbicide metabolites
Flow scintillation analyzer	LabLogic System	1103303	for HPLC analysis of 14C
Hypersil Gold C18 column	Thermo-Scientific	03-050-522	reversed phase
Ultima-Flo M cocktail	Perkin Elmer	6013579	for Flow-scintillation analyzer
Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD)	Fisher Scientific	SX18	for LSS; biodegradable
Laboratory homogenizer	Kinematica	CH-6010	homogenize leaf samples