Abstract
يبدأ عدوى الملاريا عندما يتم تلقيح المرحلة حيوان بوغي المتصورة في الجلد من مجموعة الثدييات عن طريق لدغة بعوضة. الطفيلي متحركة للغاية لا تصل إلا إلى الكبد لغزو خلايا الكبد وتتحول إلى شكل كرات الدم الحمراء المعدية. ومن يهاجر أيضا في الجلد والعقدة الليمفاوية القريبة استنزاف موقع الحقن، حيث يمكن الاعتراف بها والتي تدهورت بفعل المقيمين و / أو خلايا الدم النخاعي تجنيدهم. ذكرت التصوير حيوي داخلي تجنيد في وقت مبكر من فلوري الزاهية ليز-GFP الكريات البيض إيجابية في الجلد والتفاعلات بين sporozoites وCD11c و+ الخلايا في العقدة الليمفاوية استنزاف. نقدم هنا إجراء فعال لاسترداد، وتحديد وتعداد مجموعات فرعية خلية الدم النخاعي الذي يتم تجنيد للجلد الفأر واستنزاف العقدة الليمفاوية بعد الحقن داخل الأدمة للتحصين جرعة من sporozoites في نموذج الفئران. يوفر التوصيف المظهري باستخدام التدفق متعدد حدودي الخلويمقايسة موثوقة لتقييم أوائل التغيرات الخلوية الحيوية خلال الاستجابة الالتهابية للعدوى المتصورة.
Introduction
الملاريا هي واحدة من أعنف الأمراض المعدية في العالم، مما أسفر عن مقتل أكثر من نصف مليون شخص سنويا. العدوى عن طريق المتصورة، العامل المسبب للمرض، يبدأ من مرحلة ما قبل الكريات الحمر (PE). خلال هذه المرحلة، sporozoites حقنها في الجلد المضيف عن طريق البعوض أنوفيلي الإناث تصل إلى الكبد عن طريق الدم وتفرق خلايا الكبد الداخل في أشكال الطفيليات التي تصيب خلايا الدم الحمراء وتسبب أعراض المرض.
المراحل PE المتصورة تمثل هدفا مميزا لقاح لمكافحة الملاريا. في الواقع، ويعيش اللقاحات الموهنة ضد هذه المراحل، مثل الإشعاع الموهن sporozoites (RAS)، وقد أثبتت الطفيليات القبض وراثيا (GAP) أو الوقاية الكيميائية وsporozoites (CPS) قدرتها على حماية كل من القوارض والمضيفين البشري 1-9. في نموذج القوارض، وتجرى معظم الدراسات التطعيم باستخدام التطعيم عن طريق الحقن، الذي هو معيار الذهب من حيث الفعالية واقية. ومع ذلك، لم يتغير وصف مرحلة الجلد وأهمية العقدة الليمفاوية المرتبطة الجلد استنزاف (DLN) في انتزاع حماية تصورنا للمرحلة PE، وشدد على أهمية الطريق داخل الأدمة للحقن. التصوير حيوي داخلي من P. sporozoites berghei حقنها في الجلد من القوارض اظهر ان ~ 25٪ من اللقاح تصل إلى الكبد عن طريق الدم. ما تبقى من ~ 75٪ توزع بين DLN الداني (~ 15٪) والجلد (~ 50٪) 10،11، حيث نسبة صغيرة يمكن أن تتحول وتبقى على قيد الحياة لمدة أسابيع داخل خلايا الجلد 12،13. وعلاوة على ذلك، وصفت دراسات لاحقة أن إنشاء مناعة وقائية فعالة بعد التحصين داخل الأدمة يأخذ في المقام الأول في الجلد DLN، حيث يتم تنشيط الطفيل خلايا CD8 + T محددة، وبشكل هامشي فقط في الطحال أو الكبد dLNs 14،15.
في حينوركزت معظم الدراسات على تحديد خصائص الخلايا المستجيب المتورطين في إنشاء استجابة مناعية واقية، لا يعرف الكثير الكثير عن مصير الطفيليات الموهنة الحية حقنها في الجلد، خصوصا تفاعلاتها مع نظام المناعة الفطري. على وجه الخصوص، وتوصيف الخلايا العارضة للمستضد تشارك في الطفيلي مستضد امتصاص ومعالجة وعرض لخلايا CD8 + T هو من الأهمية بمكان، مع العلم أن يمكن أن يحدث PE اكتساب مستضد على حد سواء في الجلد ومقصورات DLN. ووصفت الدراسات السابقة التصوير حيوي داخلي تدفق المبكر للخلايا إيجابية فلوري الزاهية ليز-GFP في الجلد بعد عضة البعوض المعدية 16 في حين لوحظ التفاعل مبكرة بين sporozoites والخلايا الجذعية في DLN 10،17. وفي الآونة الأخيرة، تم الإبلاغ عن أن sporozoites تلقيح في الجلد عن طريق البعوض يزيد من الحركة من كل من خلايا T الجذعية والتنظيمية في جلدالفئران، في حين لوحظ وجود انخفاض عدد خلايا مقدمة للمستضد في DLN 18.
نحن تهدف إلى تحديد وقياس أكثر دقة فرعية الكريات البيض جند في الجلد وDLN المقابلة وكذلك التفاعل مع الطفيل بعد الحقن داخل الأدمة للتحصين جرعة من RAS 19. في هذا السياق، ونحن عزل خلايا الدم النخاعي (CD45 + CD11b +) من كل الأنسجة وتتميز القطعان من الاهتمام من قبل عدة = تدفق حدودي الخلوي. وتمشيا مع الاستجابة المناعية هو موضح في مرحلة مبكرة من الليشمانيا كبير عدوى الجلد 20، واستجابة المضيف الأولية للحيوان بوغي حقن يتكون من التجنيد على التوالي من العدلات النوى (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C كثافة العمليات) تليها حيدات التهابات (CD45 + CD11b + Ly6G - Ly6C +) التي يتم تحديدها على أساس differentiآل التعبير عن علامات سطح Ly6G وLy6C.
نحن هنا وصف بروتوكول لعزل خلايا الدم النخاعي من الجلد الماوس وDLN بعد الحقن داخل الأدمة للتحصين جرعة من RAS المستخرج من الغدد اللعابية للبعوض المصابة. الحقن داخل الأدمة استنساخه ومعالجة الأنسجة هي الخطوات الحاسمة لتحديد التغيرات المظهرية بالتسلل السكان خلية داخل الأنسجة المصابة. النهج هو مفصل أدناه يوفر فحص موثوق لتقييم الجلد وDLN الاستجابة الالتهابية لالمتصورة الطفيليات ويمكن أن يمتد ليشمل النظم التجريبية المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة من معهد باستور واللجنة المحلية الأخلاق في التجارب على الحيوانات (لجنة الأخلاقية الجيش الإسرائيلي باريس 1 وباريس، فرنسا، وعدد اتفاق: 2012-0015)، وأجرى وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح المعمول بها.
1. المواد والكواشف
- استخدام النساء الأنوفيليس البعوض stephensi (Sda500 سلالة) التي تتغذى على الفئران المصابة 3-5 أيام بعد ظهور والخلفية كما هو موضح سابقا 21.
- استخدام الطفيليات المتصورة berghei أنكا استنساخ التعبير عن الجينات البروتين الفلوري الأخضر (GFP) تحت سيطرة التأسيسي بروتين الصدمة الحرارية 70 (HSP70) المروج. هذا ينتج مضان مشرق طوال دورة حياة الطفيل 22.
- استخدام أنثى الفئران C57BL / 6JRj (القديم أسابيع 7).
يتم سرد كافة الكواشف المستخدمة في بروتوكول صفها في تي قادرة المواد / المعدات: ملاحظة.
- بين 18-25 يوما بعد تناول وجبة الدم المعدية، وجمع والباردة تخدير البعوض في أنبوب 15 مل على الجليد كما هو موضح سابقا 21. نقلها بعناية على طبق بيتري بواسطة أنبوب للقلب. الحفاظ على الحشرات على الجليد وفضح البعوض لجرعة 12 كراد من γ- أو الأشعة التشعيع.
- عزل sporozoites الموهنة من الغدد اللعابية للبعوض المشع كما هو موضح سابقا 21. جمع الغدد اللعابية المصابة في حجم صغير (حوالي 15 ميكرولتر) من 1X Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) على الجليد وبلطف سحق لهم لإطلاق سراح sporozoites.
ملاحظة: حقن تعليق الطفيلي مركزة للغاية في حجم صغير كونها ذات أهمية بالغة، ولذا فمن الضروري أن يحصد عددا كافيا من الغدد اللعابية من عدد كبير من انتقاؤه البعوض المصابة بشكل جيد، كما يتضح من التعبير القوي بهم منالأخضر ومضان. - تصفية تعليق حيوان بوغي خلال 35 ميكرون سقف الخلية مصفاة تكييفها إلى أدنى مستوى التصاق 1.5 مل أنبوب microcentrifuge لمن أجل القضاء على كتل الحطام والبعوض.
- عد عدد من sporozoites معزولة كما هو موضح سابقا 21 وضبط تركيز تعليق الطفيلي مع البرد 1X DPBS للحصول على 83،000 sporozoites / ميكرولتر. تخزين الطفيليات على الجليد مع الاستمرار في الخطوات التالية.
- جمع عدد مماثل من الغدد اللعابية من البعوض غير المصابة التي سيتم استخدامها في السيطرة السلبية ومعالجة العينة كما هو موضح في الخطوات 2.2 و 2.3. تمييع العينة كما هو مبين أعلاه للحصول على تركيز مماثل مقتطفات من الغدد اللعابية في التعليق.
ويمكن تخزين Sporozoites على الجليد لمدة أقصاها 2 ساعة: ملاحظة. ومع ذلك، من الناحية المثالية يتم حقنها في غضون ساعة بعد سحق الغدد اللعابية.
3. حقن Sporozoites في طريق الجلد لاYER من الأذن
- تخدير الحيوانات عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين (50 ملغ / كلغ) / زيلازين (5 ملغ / كلغ) الخليط. الانتظار 5-8 دقائق لالماوس ليكون في حالة من فقدان الوعي وتطبيق مرهم للعين للعيون لمنع جفاف القرنية. تقييم عمق التخدير عن طريق إجراء قرصة اصبع القدم لطيف على كلا القدمين الخلفية.
ملاحظة: جرعة التخدير يستمر لمدة أقل من 20 دقيقة، لذلك يجب أن يتم ذلك بالخطوات التالية سريعا. - استقرار الصيوان الأذن من الماوس عن طريق تحديد الجانب البطني مع الشريط واضحة وضعت سابقا تحت مجهر تشريحي (الشكل 1A). اضغط بلطف الأذن لتجنب الضرر من الأوعية الدموية.
- تحميل 10 ميكرولتر حقنة / 35 مقياس المشطوف إبرة مع 0.6 ميكرولتر من الطفيليات معلق 10.
- تقديم تعليق حيوان بوغي في 4 مواقع الحقن (0.15 ميكرولتر لكل موقع) عن طريق إدراج بعناية الإبرة على الجانب الظهري من الأذن (الشكل 1A)، تحت البشرة، معشطبة تصل، مع الحرص على تجنب أي الأوعية الدموية. السماح للإبرة بالبقاء في الأدمة لعدد قليل من ثانية لمنع ارتجاع للinjectant قبل إزالته. مراقبة حطاطة مميزة في كل مكان الحقن في نهاية الإجراء (الشكل 1B و1C).
- بعد الحقن، وإزالة بعناية الأذن من الشريط.
- حقن الأذن المقابل بنفس جرعة من الطفيليات عن طريق اتباع الخطوات 3،2-3،4.
- حقن الفئران 2 إضافية مع أي 0.6 ميكرولتر من 1X DPBS أو 0.6 ميكرولتر من 1X DPBS + الغدة اللعابية مقتطف من البعوض غير المصابة من أجل تقييم الاستجابة الالتهابية بوساطة الحقن وحده، وترسب المواد البعوض في الأدمة.
- رصد الانتعاش الماوس من التخدير قبل وضعه مرة أخرى في قفص.
ملاحظة: ترسب حيوان بوغي السليم في الجلد يمكن رصدها بواسطة المجهر مضان (الشكل 2A و 2B)، والفأر التي يجري إعدادها على النحو المبين previsously 23.
4. الجلد وتشريح تصريف العقدة الليمفاوية
- إعداد المتوسطة القياسية (SM) على النحو التالي: Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) + 25 مم 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) تستكمل مع 400 U / مل كولاجيناز و 50 ميكروغرام / مل ديوكسي ريبونيوكلياز (الدناز) .
- إعداد اثنين 6 لوحات زراعة الأنسجة بشكل جيد شقة القاع على الجليد مع 4.5 مل SM + 70 ميكرومتر مصفاة الخلية لكل بئر للعينات DLN (لوحة أ) و 4.5 SM مل لكل بئر للعينات الجلد (لوحة B).
- عند نقطة زمنية محددة بعد تلقيح حيوان بوغي، تخدير عميق الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق الكيتامين (125 ملغ / كلغ) / زيلازين (12.5 ملغ / كلغ) مزيج خلع عنق الرحم مسبق. تأكد من الماوس يوضح علامات الموت السريري وبدء تشريح فورا.
ملاحظة: حركية تجنيد خلية الدم النخاعي يمكن فحصها في أوقات مختلفة بعد الحقنection (أي 2 ساعة و 4 ساعة و 24 ساعة كما هو موضح سابقا 14). - تطهير الأذن تلقيح ومنطقة الرقبة المقابلة مع 70٪ من الإيثانول للحد من احتمال التلوث.
- باستخدام مقص العقيمة وملقط، جو معقم و مطهر تشريح أذني DLN الداني دون جمع الدهون المحيطة بها. إجراء شق الأولى في التلم-الوداجية carotidian وإزالة الشعر من مجال التشغيل. تمتد شق مع 2 ملقط لفضح DLN الذي يظهر رمادي مقارنة مع الأنسجة المحيطة بها.
- قرصة الأنسجة الضامة بعناية على الجزء العلوي من DLN مع ملقط لتسهيل إزالتها. استخراج DLN عن طريق وضع ملقط تحت الأنسجة اللمفاوية (الشكل 3A و 3B). وضع DLN في تحتوي كذلك 4.5 مل SM + 70 ميكرومتر مصفاة الخلية (لوحة A).
- حصاد الأذن تلقيح بأكملها باستخدام مقص وملقط (الشكل 4A) حادة معقمة. Separأكل ظهري وبطني جوانب الأذن عن طريق معسر وتباعد عدا قطع ينتهي مع اثنين من ملقط (الشكل 4B - 4E). وضعها في تحتوي كذلك 4.5 مل SM (لوحة ب) التأكد مغمورة تماما على حد سواء الأنسجة في المتوسط.
ملاحظة: من أجل تحسين موثوقية التجربة وزيادة عدد خلايا الفائدة، تجمع 2 حقن الأذنين أو 2 dLNs من نفس الماوس في العينة. - الحصاد وعملية في نفس الوقت الأذنين وdLNs من الفئران الملقحة إما 1X DPBS أو مقتطفات الغدة اللعابية. وتشمل 2 عينات الأذن والعقدة الليمفاوية إضافية تحصد من الماوس السذاجة لضوابط التعويض تلطيخ السلبية واحدة.
5. عزل الخلايا من العقد الليمفاوية
- احتضان الغدد الليمفاوية (لوحة أ) عند 37 درجة مئوية + 5٪ CO 2 لمدة 15 دقيقة تحت الإثارة لطيف. إضافة ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل 10 ملي النهائي (EDTA) لكل بئر لتحييد كولاجيناز والدناز تشغيل إشاراتvities. نفذ الخطوات التالية على الجليد.
- فصل الغدد الليمفاوية باستخدام الحد الاعلى من 5 مل حقنة الغطاس. الصحافة في حركات دائرية ضد مصفاة حتى كل ما تبقى هو الأنسجة الضامة البيضاء.
- شطف مصفاة الخلية مرتين مع 500 DPBS 1X ميكرولتر + 2٪ الجنين المصل البقري (FBS) + 2mm و EDTA. نقل كامل حجم البئر في أنبوب 15 مل.
- شطف مرتين جيدا مع 500 DPBS 1X ميكرولتر + 2٪ FBS + 2mm و EDTA ونقل الصوت في أنبوب 15 مل. إبقاء الأنابيب على الجليد.
6. عزل الخلايا من الجلد من الأذن
- احتضان منشورات الأذن (لوحة B) عند 37 درجة مئوية + 5٪ CO 2 لمدة 1 ساعة في إطار التحريض لطيف.
ملاحظة: بعد 20 دقيقة من الحضانة، وقطع منشورات الأذن مع مقص الى قطع صغيرة لتسهيل عملية الهضم الأنسجة ووضع العينة مرة أخرى في الحاضنة لمدة 40 دقيقة المتبقية. الخلايا وحيدة يمكن ملاحظتها على المدى المتوسط في نهاية فترة حضانة. - إضافة 10 نهائي ملي EDTA لكل بئر لتحييد الأنشطة كولاجيناز والدناز. نفذ الخطوات التالية على الجليد.
- نقل أجزاء الأنسجة الأذن وحجم كله المتوسطة في جديدة تحتوي أيضا مصفاة الخلية 70 ميكرومتر باستخدام ماصة 1ML. قطع 2-3 ملم من نهاية طرف لجمع شظايا الأنسجة الأذن بسهولة أكبر.
- فصل أجزاء الأنسجة الأذن باستخدام الحد الاعلى من 5 مل حقنة الغطاس. الصحافة في حركات دائرية ضد مصفاة حتى كل ما تبقى هو الأنسجة الضامة البيضاء.
- شطف مصافى الخلية مرتين مع 500 DPBS 1X ميكرولتر + 2٪ FBS + 2 ملي EDTA.
- نقل وحدة التخزين بالكامل من البئر إلى 50 مل أنبوب من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرون.
- شطف جيدا مع 500 ميكرولتر 1X DPBS + 2٪ FBS + 2 ملي EDTA ونقل الصوت في أنبوب 50 مل. الحفاظ على أنبوب على الجليد.
ملاحظة: الخطوات المختلفة لعزل مجموع الخلايا من الجلد والأنسجة وتتلخص DLN في الشكل (5).
- أجهزة الطرد المركزي الجلد وعينات DLN لمدة 5 دقائق في 450 x ج في 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف. resuspend بلطف بيليه مع 300 DPBS 1X ميكرولتر + 2٪ FBS + 2 ملي EDTA.
- اجمع كمية صغيرة من كل عينة لحساب العدد الكلي للخلايا معزولة من الجلد وDLN باستخدام عدادة الكريات. إضافة 0.04٪ أزرق التريبان لتحديد بقاء الخلية.
8. حجب غير مستضد محددة وملزمة
- إضافة 10 ميكروغرام / مل من CD16 لا تحمل علامات / CD32 FC-كتلة الجسم المضاد. احتضان 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية (يمكن أن تذهب أطول).
- إضافة 2 مل من البرد 1X DPBS + 2٪ FBS + 2 ملي EDTA. الطرد المركزي العينة لمدة 5 دقائق في 450 x ج في 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف. resuspend بلطف بيليه مع 300 DPBS 1X ميكرولتر + 2٪ FBS + 2 ملي EDTA والحفاظ على عينات على الجليد.
9. الجلد تلطيخ وخلايا العقدة الليمفاوية متعلق بالنخاع الشوكي
- احتضان التزلج منعت سابقان وDLN عزل الخلايا مع لايف / تعقب الميت (أي 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole أو دابي)، ومكافحة CD45 ومكافحة CD11b أجسام مضادة محددة.
ملاحظات: من أجل إثراء القطعان خلية الدم النخاعي من الفائدة، وخاصة النادرة منها، CD45 + الخلايا والخلايا الليمفاوية يمكن تنقيته على التوالي من الجلد أو المنضب من DLN التي كتبها حبة المغناطيسي خلية تسهيل الفرز. منذ أكثر من خلايا معزولة عن DLN هي CD45 +، واستخدام الألغام المضادة للCD45 ليس إلزاميا. يمكن تضمين علامات أخرى لتحديد الفئات السكانية خلية الدم النخاعي من الفائدة عن طريق استراتيجية إيجابية أو سلبية، المعزولة. في هذا البروتوكول، وقد أثرى خلايا الدم النخاعي تجنيدهم في DLN باستبعاد CD8α + الخلايا (حجرة الخلايا التائية كلها يمكن أن تكون مستهدفة من قبل استخدام الألغام المضادة للCD3 الأجسام المضادة المحددة). - احتضان 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام. إضافة 500 DPBS 1X ميكرولتر + 2٪ FBS + 2 ملي EDTA، الطرد المركزي العينة 5 دقائق في 450 x ج في 4 درجات مئوية، وتجاهل سوبrnatant. كرر الخطوة غسل مرتين.
- Resuspend والعينات مع 300 DPBS 1X ميكرولتر + 2٪ FBS + 2 ملي EDTA. نقل وحدة التخزين بالكامل في أنبوب FACS من خلال مصفاة الخلية 35 ميكرون. شطف تصفية مع 100 DPBS 1X ميكرولتر + 2٪ FBS + 2 ملي EDTA.
- تشغيل الخلايا الملون في عداد الكريات التدفق. بوابة تعيش خلايا مفردة (دابي - FSC-W) لاستبعاد الخلايا الميتة والحلل. مؤامرة CD45 + CD11b + الأحداث للبشرة (الشكل 6A) و (CD45 +) CD8α - CD11b + الأحداث لDLN (الشكل 6B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن حقن إبرة حقنة من جرعات تحصين من P. berghei sporozoites في الجلد الماوس يؤدي الى تجنيد التوالي العدلات النوى تليها حيدات التهابات في الجلد وDLN 19. وصف القسم بروتوكول تفاصيل فوق الإجراءات المستخدمة لعزل خلايا الدم النخاعي الحية من كل من الأنسجة التالية حقنات متعددة من عدد كبير من sporozoites في الأدمة الأذن بنجاح (الشكلان 1 و 2). خلال أول 24 ساعة، كانت DLN (الشكل 3) وموقع حقن الجلد (الشكل 4) معزولة ومعالجتها على النحو الموجز في الشكل (5) لتحليل تسلل الخلوية بواسطة التدفق متعدد حدودي الخلوي. عموما، هذه التقنية تسمح لنا لعزل بمعدل 10 4 CD45 + CD11b + و 2.10 4 CD11b + الخلايا وحيدة حيةللبشرة وDLN على التوالي. وتراوحت جدوى مقبولة من الخلايا غير الحطام واحدة 40-70٪ للبشرة و70-90٪ لDLN. كما هو مبين في الشكل (6)، وتواتر خلايا الدم النخاعي في الجلد (CD45 + CD11b +) وDLN (CD8α - CD11b +) بقوة الزيادات التالية الحقن داخل الأدمة للRAS مقارنة مع الفئران غير المصابة.
الشكل 1: أنا ntradermal حقن Sporozoites في الأذن من الفأر. (أ) صورة تظهر الحقن داخل الأدمة للsporozoites في الصيوان الأذن من الماوس تخدير. واستقرت الجانب البطني من الأذن مع الشريط واضحة وضعت سابقا تحت المجهر تشريح. يتم إدخال إبرة بعناية على الجانب الظهري من الأذن، تحت البشرة، مع شطبة تصل. (B - C) صور تظهر الجانب الظهري من الصيوان الأذن المسبق (ب) وبعد (حقن C) الأدمة من 0.1-0.2 ميكرولتر من تعليق الطفيلي. وحطاطة المميزة (السهم الأسود) هي ملاحظتها في موقع الحقن في نهاية العملية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
. الشكل 2: تصوير Sporozoites مودعة في الأدمة الأذن من الماوس (A) الإسفار المجهري تبين RAS المهاجرة من موقع الحقن (المشار إليها الخطوط المتقطعة) في الجلد الماوس 15 دقيقة بعد الحقن (شريط مقياس = 60 ميكرومتر، 10X التكبير). ويمثل مسار sporozoites من الحد الأقصى لإسقاط شدة إشارة الفلورسنت. الأخضر والأحمر إعادة مضانعرض spectively موقف الطفيلي في الجلد في البداية وبعد 10 ثانية من الاستحواذ. (ب) التكبير العالي للRAS (الأخضر) حقن في الجلد (شريط مقياس = 20 ميكرومتر، 25X التكبير). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): تصريف العقدة الليمفاوية تجهيز (A) صورة تظهر تشريح DLN أذني الداني بعد الحقن داخل الأدمة من إيفانس الأزرق لأغراض العرض التوضيحي. بعد خلع عنق الرحم من الفأرة، وتطهير الرقبة مع الايثانول 70٪. يتم إجراء شق الأول في منطقة الوريد، الشريان السباتي مع مقص حاد ويتم إزالة الجلد من مجال التشغيل. ويمتد شق مع 2 ملقط لفضح DLN التي تظهر غرامعايش مقارنة مع الأنسجة المحيطة بها. ثم يتم مقروص الأنسجة الضامة بعناية مع ملقط على الجزء العلوي من DLN وفصلها تدريجيا من ذلك. وأخيرا، يتم استخراج DLN عن طريق وضع ملقط تحت الأنسجة اللمفاوية. (ب) صورة تبين DLN المستخرج في قطرة من برنامج تلفزيوني. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: الأذن معالجة الجلد صور تبين خطوات متتالية لمعالجة الأذن تلقيح. (A) بعد خلع عنق الرحم من الفأرة، وتطهير الأذن مع 70٪ من الإيثانول وإزالتها باستخدام مقص وملقط حادة معقمة. (B - D) يتم فصل ظهري وبطني جوانب من الأذن برفق بواسطة معسر والصورةسرعة عدا قطع ينتهي مع اثنين من الملقط. (E) صورة تظهر ظهري وبطني جوانب الأذن العلاج الأنزيمية السابقة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: بروتوكول ملخص تمثيل تخطيطي من الخطوات الرئيسية لعزل مجموع الخلايا من الجلد والأنسجة DLN الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: النخاعي السكان خلية معزولة من الجلد الأذن والدانية DLN التمثيلية FACS المؤامرات تظهر.استراتيجية النابضة لتحليل مقصورة الدم النخاعي في الجلد (A) وDLN (B). تم بوابات الخلايا CD11b + على إجمالي الأحداث القميص الحية للبشرة وDLN على التوالي - CD45 + CD11b + وCD8α. لكل حالة، تم الحصول على 5 × 10 5 مجموع الأحداث (2 الأذنين وتجميع 2 DLN في العينة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في وجهة نظر تطعيم واسعة النطاق من البشر باستخدام لقاح الملاريا حيوان بوغي كله، واحدا من التحديات الرئيسية للتغلب هو تطوير طرق وأساليب الإدارة الطفيلي الأمثل لضمان التحصين الناجح وحماية 24،25. في البشر، وقد تم إجراء تقييم فعالية وقائية بوساطة الطفيليات الموهنة الحية (LAP) بعد البعوض الطبيعية لدغ 2، وكذلك الأدمة، تحت الجلد 25،26 والرابع التحصينات 27. وكما ورد في القوارض 28 و الرئيسيات غير البشرية 25، الإدارة الرابع من LAP تحرض استجابة مناعية وقائية أقوى بالمقارنة مع الطرق المذكورة أعلاه. ومع ذلك، والطرق غير IV-الإدارة باستخدام الإبر والمحاقن لا يزال أكثر ملاءمة للتطعيم جماعية البشري ويجري حاليا بذل جهود لتحسين فعاليتها واقية.
الدراسات الحديثة التي أجريت على الفئران أظهرتد، وخاصة في حالة الطريق الهوية، والتي ترسب كمية صغيرة من تعليق حيوان بوغي (المدى من 1 ميكرولتر) في مواقع الحقن متعددة (4 نقاط) زيادة كبيرة العدوى طفيل مقارنة مع التلقيح واحد من الطفيليات المخفف في حجم أكبر (50 ميكرولتر) 24. في نظامنا التجريبي (C57BL / 6 الماوس - P. berghei)، وقد تحقق حماية كاملة بعد حقن متعددة في الأدمة الأذن تعليق مركزة للغاية من الطفيليات (50000 RAS في 0.6 ميكرولتر و 4 مواقع الحقن) 19. في هذا السياق، أنشأنا بروتوكول المذكورة أعلاه لتحليل أكثر دقة المضيف الاستجابة المناعية المحلية لتحصين جرعة من RAS التي سمحت لنا بالتعرف 2 كبرى مجموعات فرعية خلية الدم النخاعي تجنيدهم في الجلد وDLN ردا على الطفيلي 19.
تدفق متعدد حدودي يسمح الخلوي تحديد دقيق وتقدير التغيرات الخلايا المناعية في سياق استجابة المضيفللإصابة 19،20. عزل عدد كبير من خلايا قابلة للحياة وبالتالي حاسما لإجراء تحليل المظهري استنساخه. لهذا الغرض، يجب أن يكون الأمثل للتركيز الانزيم ومدة الهضم الأنسجة. في الواقع، تركيز منخفض من الانزيمات أو عدم كفاية فترة حضانة قد تؤدي إلى الهضم غير مكتملة مع العائد المنخفض من الخلايا في حين الهضم الأنسجة لفترات طويلة قد يؤدي إلى بقاء الخلية الانخفاض وتغيير سطح الخلية مستضد التعبير 29. ومع ذلك، فقد ثبت بروتوكولات راسخة باستخدام العلاج كولاجيناز أن يكون لها تأثير هامشي على الكشف عن جزيئات السطح ذات الصلة في كثير من الأحيان تستخدم لالمظهري تحليل 30.
ومن بين العديد من المعلمات التي يمكن تحسين نوعية العزلة الخلية، والفصل بين ظهري وبطني أقسام للجلد الأذن ضروري، لأنه يسمح للكولاجيناز / الدناز للوصول إلى الأدمة. وبالإضافة إلى ذلك، تنميق الجلد إلى صغيرةقطع يزيد من مساحة السطح الوصول إلى الإنزيمات، وبالتالي السماح للأقصر مدة الهضم. وأخيرا، واستخدام التفكك الميكانيكية يساعد على زيادة الغلة في عدد الخلايا لكل من الجلد وDLN. ومع ذلك، يمكن أن تفارق المفرط يسبب الإجهاد الإضافي الذي يمكن أن يؤثر سلبا على بقاء الخلية.
فضلنا اكتساب الخلايا الحية منذ تثبيت يؤدي إلى تلطيخ الأمثل، مما يعقد تمييز من الأحداث الإيجابية النادرة من الفائدة (لا تظهر البيانات). وعلاوة على ذلك، كان التمييز من الخلايا الميتة أكثر صعوبة. في الحالات التي تتطلب تثبيت الخلية، نقترح استخدام يمكن حلها DEAD البقع الخلية الحية / الميت.
باستخدام بروتوكول محددة، فإننا خلايا الدم النخاعي معزولة بنجاح التسلل إلى الجلد وDLN ردا على الطفيلي حقن (الشكل 6A و B). ونحن عادة الحصول على مستويات أعلى من الخلايا واحدة قابلة للحياة من DLN (70-90٪) مقارنة معالجلد (40-70٪). هذا الاختلاف يمكن تفسير فترة حضانة أطول اللازمة لعملية الهضم الأنزيمي كفاءة جنبا إلى جنب مع خطوات إضافية من التفكك الميكانيكية لعزل خلايا الجلد (البشرة فصل طبقة، تنميق ويهرس أقوى).
وأخيرا، معيارا هاما لتأخذ في الاعتبار عند تحليل استجابة المضيف لحقن معرف sporozoites هو مستوى الالتهاب الناجم عن كلا إبرة واللعابية للبعوض استخراج الغدة ترسب في الجلد 19،20. لذا نقترح أن حقن الفئران إضافي مع أي برنامج تلفزيوني 1X وحدها أو مقتطفات الغدة اللعابية من نفس العدد من البعوض غير المصابة لتقييم الاستجابة المناعية التي يسببها خصيصا من قبل الطفيلي. وإجمالا، فإننا ننصح لتشريح البعوض المصابة مع الحمل الطفيلي عالية في الغدد اللعابية ولتصفية تعليق الطفيلي للحد من كمية المواد البعوض الذي يمكن إيداعها في الجلد.
أناملخص ن، وعزل خلايا الدم النخاعي من الجلد وDLN من خلال بروتوكول صفها تقدم مقايسة موثوقة لتقييم التغيرات الخلوية الحيوية خلال الاستجابة الالتهابية للعدوى المتصورة، ويمكن أن تمتد إلى مسببات الأمراض الأخرى التي تنتقل إلى الجلد للمضيف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
الكتاب أشكر باتريشيا Baldacci، فانيسا Lagal وسابين Thiberge لقراءة نقدية، إيرينا Dobrescu وسابين Thiberge للمساعدة في التقاط الصور وبولين Formaglio للتعليم في مجال التصوير المجراة من الحركة حيوان بوغي في الجلد الماوس. كما نود أن نشكر ماريك Szatanik ومركز للإنتاج وإصابة بعوضة (CEPIA-معهد باستور) لتربية البعوض. وأيد هذه الدراسة من قبل الصندوق AXA البحوث والأموال من مختبر دي التميز "البيولوجيا التكاملية من الأمراض المعدية الناشئة" (منح رقم وكالة الاستخبارات الوطنية-10-LABX-62-IBEID).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine: Imalgene® 1,000 | Merial | - | 50 mg/kg: prior sporozoite injection 125 mg/kg: prior sacrifice |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | - | 5 mg/kg: prior sporozoite injection 12.5 mg/kg: prior sacrifice |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | - | - |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0.5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | - |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | - |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | - |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | - |
| BLUE MAXTM 15 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | - |
| BLUE MAXTM 50 ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | - |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35 µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | - |
| DPBS 1x CaCl2- and MgCl2--free | Life Technologies | 14190-094 | - |
| DMEM 1x + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | - |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10 mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | - |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10 µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1 µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | - | - |
References
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
- Hoffman, S. L., et al. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).
- Mueller, A. K., et al. Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).
- Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).
- van Dijk, M. R., et al. Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).
- Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites. Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).
- Belnoue, E., et al. Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment. J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).
- Behet, M. C., et al. Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Malar J. 13, 136 (2014).
- Amino, R., et al. Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal. Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).
- Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site. Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).
- Gueirard, P., et al. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).
- Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection. Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).
- CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. Nat Med. Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. 13 (9), (2007).
- Obeid, M., et al. Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria. EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).
- Amino, R., et al. Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver. Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).
- Radtke, A. J., et al. Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses. PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).
- da Silva, H. B., et al. Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites. Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).
- Mac-Daniel, L., et al. Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin. J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).
- Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response. PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).
- Thiberge, S., et al. In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).
- Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell. Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).
- Amino, R., et al. Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host. Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).
- Ploemen, I. H., et al. Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents. Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Roestenberg, M., et al. Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study. Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).
- Seder, R. A., et al. Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine. Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).
- Douradinha, B., et al. Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection. Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J Vis Exp. (63), e4040 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).
