الإجراءات في يحفز الزرق<em> في فيفو</em> نموذج الفأر وجبل لالجامع إعداد الشبكية

Summary

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Abstract

الجلوكوما هو مرض يصيب الجهاز العصبي المركزي التأثير على الخلايا الشبكية العقدة (RGCs). محاور RGC التي تشكل العصب البصري تحمل المدخلات البصرية إلى الدماغ لالإدراك البصري. الأضرار التي لحقت RGCs والمحاور التي تؤدي إلى فقدان البصر و / أو العمى. على الرغم من أن السبب المحدد الزرق غير معروف، عامل الخطر الرئيسي لهذا المرض هو ضغط العين المرتفع. إجراءات إحداث الزرق في النماذج الحيوانية هي أداة قيمة للباحثين دراسة آلية الموت RGC. هذه المعلومات يمكن أن يؤدي إلى تطوير علاجات اعصاب الفعالة التي يمكن أن تساعد في الوقاية من فقدان البصر. يصف بروتوكول في هذه الورقة وسيلة لإحداث الزرق – مثل الأوضاع في نموذج الفئران في الجسم الحي حيث يتم حقن 50 ميكرولتر من 2 M المالحة مفرط التوتر في الضفيرة الوريدية فوق الصلبة. ابيضاض الأوعية يدل على نجاح الحقن. يؤدي هذا الإجراء فقدان RGCs لمحاكاة الزرق. شهر واحد بعدحقن، يتم التضحية الحيوانات وتتم إزالة العينين. بعد ذلك، يتم إزالة القرنية، العدسة، وزجاجي لجعل فنجان العين. غير المقشر ثم شبكية العين من الجزء الخلفي من العين ويعلق على أطباق sylgard باستخدام الإبر الصبار. عند هذه النقطة، الخلايا العصبية في شبكية العين يمكن أن تكون ملطخة لتحليلها. وتظهر النتائج من هذا المعمل أن ما يقرب من 25٪ من RGCs فقدت خلال شهر واحد من إجراء بالمقارنة مع الضوابط الداخلية. يسمح هذا الإجراء للتحليل الكمي من شبكية العين موت الخلايا العقدية في الجسم الحي في الفئران نموذج الزرق.

Introduction

الزرق هو مجموعة من الأمراض التي تؤثر على العين الخلايا العصبية في شبكية العين، وتحديدا، فإن خلايا الشبكية العقدة ^1-2. المحاور من هذه الخلايا تلتقي ليصبح العصب البصري تحمل المعلومات البصرية إلى الدماغ حيث ينظر الرؤية. وبالتالي الأضرار التي لحقت RGCs والمحاور التي تسبب العيوب البصرية.

الخصائص الأساسية المرتبطة بالاضطرابات الجلوكوما هي RGC الضمور والموت، وزيادة ضغط العين (IOP)، والحجامة القرص البصري وضمور. هذه الميزات تؤدي إلى فقدان البصر أو كامل، والعمى لا رجعة فيه. حاليا، وقد تسبب العمى الزرق في 70 مليون شخص في جميع أنحاء العالم ^3. على هذا النحو، هو ثالث أكبر سبب في العالم للعمى ^4.

الآلية الدقيقة للوفاة RGC في الزرق لا تزال مجهولة. تم إجراء الكثير من البحوث إلى فك لغز. ومن المعروف، مع ذلك، أن عامل الخطر الرئيسي للزرق هو زيادة طن ضغط العين بسبب الدورة الدموية وعدم انتظام الخلط المائي (ه) في الغرفة الأمامية للعين. يعمل ه كبديل شفاف وعديم اللون للدم في الغرفة الأمامية اوعائية من العين. انها تغذي الخلايا المحيطة، ويزيل النفايات يفرز من عمليات التمثيل الغذائي والنقل الناقلات العصبية، ويسمح بتداول المخدرات وخلايا التهابية داخل العين أثناء الحالات المرضية ^1.

صيانة تداول الخلط المائي ينطوي على الجسم الهدبي والشبكة التربيقية. ويتم إنتاج الخلط المائي من الجسم الهدبي. ومن ثم يصب في الغرفة الأمامية للحفاظ على الصحة العامة للأنسجة العين. ويفرز 80٪ من تدفق الخلط المائي بنشاط من خلال ظهارة الهدبية غير صباغية عندما يتم تصفية السوائل من خلال ثلاث طبقات من الأنسجة الاسفنجية في العضلة الهدبية – 75. مخارج السوائل من خلال شبكه التربيقية ومن خلال قناة شليم التي استباقالمنشأ في نظام الدم ^5. وتبقى 20 – 25٪ من تدفق تتجاوز الشبكة التربيقية ويفرز بشكل سلبي الترشيح الفائق ونشرها من خلال مسار-uveo صلبوي. يبدو أن هذا الطريق إلى أن تكون مستقلة نسبيا من ضغط العين ^1.

عندما إنتاج الخلط المائي وتدفق هم من التوازن، ويبني الضغط داخل العين. وكما ذكر، فإن هذه الزيادة في ضغط العين هو عامل الخطر الرئيسي في تطوير الزرق. يتسبب هذا الضغط الأضرار التي لحقت طبقات معقدة من الخلايا العصبية في الشبكية في الجزء الخلفي من العين. الأضرار التي لحقت محاور الخلايا الشبكية العقدة من العصب البصري يتسبب في الدماغ للم تعد تتلقى المعلومات البصرية دقيقة. ونتيجة لذلك، فقد تصور الرؤية ويمكن أن يحدث العمى الكامل.

حتى الآن، لا يوجد علاج لزرق. توجد طرق العلاج المختلفة التي تهدف في المقام الأول إلى تقليل الضغط داخل العين. وتشمل هذه الموضعيةدروس الأدوية مثل حاصرات مستقبلات هرمون التوتر beta1، أو نظائرها البروستاغلاندين الموضعية. حاصرات بيتا تقلل من ضغط العين عن طريق تقليل إنتاج الخلط المائي ^7. تعمل البروستاجلاندين للحد من IOP عن طريق زيادة تدفق الخلط المائي ^8-14. تستخدم ألفا مستقبلات هرمون التوتر ومثبطات الأنهيدراز الكربونيك أيضا أساليب الثانوية من العلاج. ألفا مستقبلات هرمون التوتر زيادة تدفق من خلال مسار uveoscleral ^15-17. مثبطات الأنهيدراز الكربونيك تقلل من إنتاج ه عن طريق تثبيط الأنزيمي ^18. بكثير كما يجري استخدام إجراءات أكثر الغازية لعلاج الجلوكوما. ويستخدم الليزر رأب التربيق لزيادة تدفق الخلط المائي ^19. العلاج الجراحي آخر، دعا trabeculectomy، ويخلق الموقع الصرف بديل لتصفية ه عندما يتم حظر مسار تربيقية التقليدي ^20-21.

من المعروف أن هذه خيارات العلاج لممثل المؤسسةectively تقليل الضغط داخل المقلة. ومع ذلك، ما يصل إلى 40٪ من المرضى الزرق تظهر مستويات IOP العادية مما يدل على الحاجة إلى أساليب علاجية أكثر اكتمالا. ^22،23 بالإضافة إلى ذلك، في شبكية العين موت الخلايا العقدية ينظر في الزرق لا رجعة فيه بمجرد أن يبدأ والعلاجات الحالية لا تتوقف تطور المرض ^24-28. وقد أبرزت هذه الحاجة لعلاجات اعصاب الفعالة التي تستهدف بقاء الخلايا العصبية نفسها. تطوير نماذج الزرق أمر حاسم لهذا التطور.

في هذه الدراسة تظاهرنا وسيلة لإحداث آثار مثل الزرق في الفئران طويل ايفانز البالغين باستخدام إجراء تعديل المبينة في الأصل من قبل موريسون ^(29). في هذا الإجراء، والحقن من 2 M المالحة مفرط التوتر في الضفيرة الوريدية فوق الصلبة تحرض ظروف شبيهة الزرق التي تندب أنسجة للحد من تدفق مائي النكتة في الشبكة التربيقية مما يؤدي إلى زيادة في ضغط العين وخسارة كبيرة من RGCs ثithin شهر واحد من إجراء ^30-31. إجراءات إحداث الزرق، مثل تلك المذكورة هنا، قد يكون المفتاح لفتح التطورات الجديدة في علاج الجلوكوما.

Protocol

وكانت جميع الإجراءات باستخدام المواد الحيوانية وفقا لمعايير معهد رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC) في جامعة ميشيغان الغربية. 1. الحيوانات استخدام الذكور والإناث الفئران 3 أشه?…

Representative Results

يوضح هذا القسم مكونات الأجهزة والإجراءات المستخدمة للحث على ظروف شبيهة الزرق في الجسم الحي في الفئران نموذج الزرق. نقدم لك مجموعة من الأدوات الفردية والمعدات المستخدمة لإجراء الحقن بالمحلول الملحي مفرط التوتر الذي يسبب زيادة في ضغط العين. نقد…

Discussion

يصف هذا البروتوكول وسيلة لإحداث ظروف شبيهة الزرق في الجسم الحي في نموذج الفئران. يستخدم هذا الإجراء حقن محلول ملحي مفرط التوتر للحث على تندب في الشبكة التربيقية ^{29، 32.} تطوير ندبا تسبب انسداد تدفق الخلط المائي مما يزيد الضغط في الغرفة الأمامية. مع انخفاض تدف?…

Materials

Xylazine hydrochloride, Minimum 99%	Sigma, Life Science	X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/mL	Putney, Inc	NDC 26637-411-01	10 mL bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/mL	Phoenix Pharmaceutical, Inc	NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408	50 mL bottle
Serum bottle, 10 mL	VWR	16171319	Borosilicate glass
1 mL insulin syringe	VWR	BD329410	28 gauge needle
Sodium chloride	Sigma	S7653	2 M Solution
Microelectrode Puller	Narishige Group	PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-10HP	without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes	World Precision Instruments, Inc	MF28G
18 gauge Luer-Lock needle	Fisher Scientific	1130421	Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing	Fisher Scientific	22046941	0.034 inch diameter, approximately 10 inches
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%	Akorn, Inc	NDC 17478-263-12	15 mL  sterile bottle
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-11
Microscope	Leica	StereoZoom 4
Hemostat Clamp	Fine Science Tools	1310912	curved edge
Triple Antibiotic Ointment	Fisher Scientific	NC0664481
Scalpel handle	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade # 11	Fine Science Tools	10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish	VWR	351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate	Sigma, Life Science	P7059-1L	1x dilution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Forceps (2), Dumont # 5	Fine Science Tools	11251-30
3 mL Transfer Pipets, polyethylene, non sterile	BD Biosciences	357524 or 52947-948	1 and 2 mL graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish	BD Biosciences	351008
Sylgard 184	VWR	102092-312
Cactus Needles	N/A	N/A
Paraformaldehyde	EMD Millipore	PX0055-3 or 818715.0100	Made into a 4% solution
Triton X-100	Sigma	T9284-100 mL	Made into both a 1% and 0.1% solution
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biological	S11150	500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1	BD Pharmingen	Cat 554892	1:300 dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11005	1:300 dilution
Microscope Slides	Corning	2948-75×25
Glycerol	Sigma	G5516-100 mL	50% glycerol to 50% PBS, by weight
Coverglass	Corning	2975-225	Thickness 1 22 x 50 mm
Confocal Microscope	Nikon	C2 Eclipse Ti