גלאוקומה וישכנע נוהל בבית<em> In vivo</em> מודל עכברוש ואת כל הר רשתית הכנה

Summary

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Abstract

גלאוקומה היא מחלה של מערכת העצבים המרכזית הפוגעת בתאי הגנגליון ברשתית (RGCs). אקסונים RGC המרכיבים את עצב הראייה לשאת קלט חזותי למוח עבור תפיסה חזותית. פגיעת RGCs ו האקסונים שלהם מובילה לאובדן ראייה ו / או עיוורון. למרות הגורם הספציפי של גלאוקומה אינו ידוע, גורם הסיכון העיקרי למחלה הוא לחץ תוך עיני מוגבר. גלאוקומה וישכנע נהלים במודלים של בעלי חיים הם כלים רבי ערך לחוקרים לחקור את מנגנון מות RGC. מידע כזה יכול להוביל לפיתוח טיפולים נוירו יעילים שיכולים לסייע במניעת אובדן ראייה. פרוטוקול במאמר זה מתאר שיטה של גרימת גלאוקומה – כמו תנאים במודל חולדה vivo ב שם 50 μl של 2 מלוחים היפרטוני M מוזרק לתוך מקלעת ורידית episcleral. לבנה של הכלי מציינת זריקה מוצלחת. הליך זה גורם לאובדן של RGCs לדמות גלאוקומה. החודש הבאזריקה, חיות מוקרבות ועיניים יוסרו. לאחר מכן, הקרנית, העדשה, זגוגי מוסרים לעשות עיינית. הרשתית היא מקולפת ואז מהחלק האחורי של העין והצמידה על מנות Sylgard באמצעות מחטי קקטוס. בשלב זה, נוירונים ברשתית יכול להיות מוכתם לניתוח. תוצאות מהמעבדה זה מראים כי כ -25% RGCs הולכים לאיבוד בתוך חודש אחד של ההליך כאשר בהשוואה לקבוצת הביקורת הפנימית. הליך זה מאפשר ניתוח כמותי של מוות תאי הגנגליון ברשתית במודל גלאוקומה עכברוש in vivo.

Introduction

גלאוקומה היא קבוצה של מחלות עיניים המשפיעות נוירונים ברשתית, במיוחד, התאים הגנגליון ברשתית ^1-2. אקסונים של תאים אלה להתכנס על מנת להפוך את עצב הראייה נושא מידע חזותי אל המוח, שם לחזון נתפס. פגיעת RGCs ו האקסונים שלהם ולכן גורם פגמים חזותיים.

מאפייניו העיקריים הקשורים להפרעות גלאוקומה הם RGC ניוון ומוות, לחץ תוך עיני מוגבר (IOP), וכוסות רוח דיסק אופטי וניוון. תכונות אלה להוביל לאובדן שדה ראייה או מלא, לעיוורון בלתי הפיך. נכון לעכשיו, גלאוקומה גרמה עיוורון ב -70 מיליון אנשים ברחבי העולם ^3. ככזה, הוא הוא הגורם השלישי בגודלה בעולם של עיוורון ^4.

המנגנון המדויק של מות RGC בגלאוקומה נותר עלום. מחקר רב נעשה כדי לפתוח את התעלומה. זה ידוע, עם זאת, כי גורם הסיכון העיקרי של גלאוקומה היא תגדילn לחץ תוך עיני עקב זרימה סדירה הומור מימי (AH) בחדר הקדמי של העין. AH פועל כתחליף שקוף וחסר צבע לדם בתא avascular הקדמי של העין. היא מזינה את התאים הסובבים אותו, מסיר פסולת המופרשים תהליכים מטבוליים, משלוחים נוירוטרנסמיטורים, ומתירה את זרימת סמי תאים דלקתיים בתוך העין במהלך מצבי פתולוגיים ^1.

התחזוקה של זרימת הומור מימית כרוכה הגוף ריסי ואת meshwork trabecular. הומור מימי מיוצר על ידי הגוף ריסי. לאחר מכן הוא זורם לתוך החדר הקדמי כדי לשמור על הבריאות הכללית של רקמות העין. 75 – 80% יצוא הומור מימי מופרשים באופן פעיל באמצעות אפיתל ריסי הלא פיגמנט כאשר הנוזל מסונן דרך שלוש שכבות של מרקם ספוגי בשריר הריסים. יציאות הנוזל דרך meshwork trabecular ודרך התעלה של Schlemm אשר ולרומםies לתוך מערכת הדם ⁵ .the הנותרים 20 – 25% של יצוא עוקף את meshwork trabecular ומופרש באופן פסיבי על ידי אולטרה סינון ודיפוזיה דרך מסלול uveo-scleral. מסלול זה מופיע להיות עצמאי יחסי של לחץ תוך עיני ^1.

כאשר ייצור הומור מימי ו יצוא נמצא מחוץ איזון, לחץ בונה בתוך העין. כאמור, זו עלייה בלחץ התוך עיני הוא גורם הסיכון העיקרי להתפתחות גלאוקומה. לחץ כזו גורמת נזק שכבות סבוכה של נוירונים ברשתית בחלק האחורי של העין. פגיעת אקסונים תא גנגליון ברשתית של עצב הראייה גורמת למוח כבר לא מקבל מידע חזותי מדויק. כתוצאה מכך, תפיסת החזון אבדה עיוורון מוחלט יכול להתרחש.

נכון להיום, אין תרופה לגלאוקומה. שיטות טיפול שונות קיימות בעיקר שמטרתם להפחית לחץ תוך עיניים. אלה כוללים אקטואלייםכיתות תרופות כגון חוסמי הקולטן-אדרנרגיים beta1, או אנלוגים פרוסטגלנדין אקטואליים. חוסמי ביתא להפחית את הלחץ התוך עיני על ידי הפחתת הייצור של הומור מימית ^7. פרוסטגלנדינים לתפקד להפחית IOP ידי הגדלת היצוא של הומור מימי ^8-14. אגוניסטים אלפא אדרנרגיים ומעכבי anhydrase פחמתית משמשים גם כאמצעי משני של הטיפול. אגוניסטים אדרנרגיים אלפא להגדיל יצוא דרך מסלול uveoscleral ^15-17. מעכבי anhydrase פחמן להפחית את ייצור AH ידי עיכוב אנזימטי ^18. הרבה יותר פרוצדורות פולשניות גם נמצאות בשימוש לטיפול בגלאוקומה. Trabeculoplasty לייזר משמש כדי להגדיל את תזרים הומור מימית ^19. עוד טיפול כירורגים, שנקרא trabeculectomy, יוצר אתר ניקוז אלטרנטיבה לסנן AH כאשר מסלול trabecular המסורתי חסום ^20-21.

אפשרויות טיפול אלה היו ידועים EFFectively להפחית IOP. עם זאת, עד 40% של מחלת גלאוקומה להראות לרמות נורמליות IOP מה שמעידים על צורך בשיטות טיפוליות שלמות יותר. ^22,23 בנוסף, מוות של תאי הגנגליון ברשתית לראות גלאוקומה הוא בלתי הפיך פעם זה מתחיל וטיפולים נוכחיים לא לעצור את התקדמות המחלה ^24-28. זה הדגיש את הצורך טיפולים נוירו יעילים הממקדים ההישרדות של הנוירונים עצמם. פיתוח דגמי גלאוקומה הוא קריטי להתפתחות זו.

במחקר זה אנחנו מפגינים שיטה של גרימת תופעות כמו-גלאוקומת חולדות מבוגרות לונג אוונס באמצעות הליך שונה המפורטים במקור על ידי מוריסון ^29. בהליך זה, זריקות של 2 M מלוחים היפרטוני לתוך מקלעת ורידית episcleral גורם תנאים כמו-גלאוקומה על ידי הצטלקות רקמת להפחית יצוא הומור מימית של meshwork trabecular מה שמוביל לעלייה בלחץ התוך עיני ואת אובדן משמעותי של RGCs within חודש של ההליך ^30-31. גלאוקומה וישכנע נהלים, כגון זה המתואר כאן, עשויים להיות המפתח לפיצוח פיתוחים חדשים טיפולי גלאוקומה.

Protocol

כל הנהלים באמצעות בנושאים בעלי חיים היו בהתאם לסטנדרטים של לשכת טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטת מערב מישיגן. 1. בעלי חיים השתמש חולדות זכרים ונקבה גיל 3 חודשים במחקר ז?…

Representative Results

סעיף זה ממחיש את מרכיבי מנגנון הליך המשמשים כדי לעודד תנאים דמויי גלאוקומה במודל גלאוקומה in vivo חולדה. אנחנו מראים את הכלים הפרט וציוד המשמשים לבצע הזרקת סליין היפרטוני הגורמת לעלייה בלחץ התוך עיני. אנו מציגים את ההזרקה לתוך המקלעת ורידית episcleral…

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה של גרימת תנאים כמו-גלאוקומה במודל חולדה vivo. הליך זה משתמש זריקה של תמיסת מלח היפרטוני לגרום הצטלקות של meshwork trabecular ^{29, 32.} פיתוח רקמה צלקתית עלולות לחסום את יצוא הומור מימי אשר מגביר את הלחץ בלשכה הקדמית. עם יצוא ולחץ ירד להצטבר, העדשה מושע…

Materials

Xylazine hydrochloride, Minimum 99%	Sigma, Life Science	X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/mL	Putney, Inc	NDC 26637-411-01	10 mL bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/mL	Phoenix Pharmaceutical, Inc	NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408	50 mL bottle
Serum bottle, 10 mL	VWR	16171319	Borosilicate glass
1 mL insulin syringe	VWR	BD329410	28 gauge needle
Sodium chloride	Sigma	S7653	2 M Solution
Microelectrode Puller	Narishige Group	PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-10HP	without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes	World Precision Instruments, Inc	MF28G
18 gauge Luer-Lock needle	Fisher Scientific	1130421	Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing	Fisher Scientific	22046941	0.034 inch diameter, approximately 10 inches
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%	Akorn, Inc	NDC 17478-263-12	15 mL  sterile bottle
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-11
Microscope	Leica	StereoZoom 4
Hemostat Clamp	Fine Science Tools	1310912	curved edge
Triple Antibiotic Ointment	Fisher Scientific	NC0664481
Scalpel handle	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade # 11	Fine Science Tools	10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish	VWR	351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate	Sigma, Life Science	P7059-1L	1x dilution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Forceps (2), Dumont # 5	Fine Science Tools	11251-30
3 mL Transfer Pipets, polyethylene, non sterile	BD Biosciences	357524 or 52947-948	1 and 2 mL graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish	BD Biosciences	351008
Sylgard 184	VWR	102092-312
Cactus Needles	N/A	N/A
Paraformaldehyde	EMD Millipore	PX0055-3 or 818715.0100	Made into a 4% solution
Triton X-100	Sigma	T9284-100 mL	Made into both a 1% and 0.1% solution
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biological	S11150	500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1	BD Pharmingen	Cat 554892	1:300 dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11005	1:300 dilution
Microscope Slides	Corning	2948-75×25
Glycerol	Sigma	G5516-100 mL	50% glycerol to 50% PBS, by weight
Coverglass	Corning	2975-225	Thickness 1 22 x 50 mm
Confocal Microscope	Nikon	C2 Eclipse Ti