Glaucoma auslösende Verfahren in ein<em> In Vivo</em> Rat Modell und Whole-mount Retina Vorbereitung

Summary

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Abstract

Das Glaukom ist eine Erkrankung des zentralen Nervensystems retinale Ganglionzellen (RGCs). RGC Axone des Sehnervs führen für die visuelle Wahrnehmung an das Gehirn visuelle Eingabe bilden. Schäden an RGCs und ihre Axone führt zu Verlust der Sehkraft und / oder Blindheit. Obwohl die spezifische Ursache des Glaukoms nicht bekannt ist, ist der Hauptrisikofaktor für die Erkrankung ein erhöhter Augeninnendruck. Glaucoma-induzierende Verfahren in Tiermodellen sind ein wertvolles Werkzeug für Forscher, den Mechanismus der RGC Tod studieren. Diese Informationen können zur Entwicklung von wirksamen neuroprotektiven Behandlungen führen, die bei der Prävention von Verlust der Sehkraft unterstützen könnte. Das Protokoll in diesem Dokument beschreibt ein Verfahren Glaukom induzieren – ähnlichen Bedingungen in einem in vivo Rattenmodell , bei dem 50 ul von 2 M hypertonen Kochsalzlösung in das episkleralen venösen Plexus injiziert. Blanchieren der Gefäße zeigt die erfolgreiche Injektion. Dieses Verfahren führt zu einem Verlust von RGCs Glaukom zu simulieren. Einen Monat nachInjektion werden die Tiere getötet und die Augen entfernt. Als nächstes werden die Hornhaut, Linse und Glaskörper entfernt, um eine Okularmuschel zu machen. Die Netzhaut wird dann von der Rückseite des Auges geschält und auf Sylgard Gerichte mit Kaktus Nadeln festgesteckt. An diesem Punkt Neuronen in der Netzhaut kann zur Analyse gefärbt werden. Die Ergebnisse aus diesem Labor zeigen, dass etwa 25% der RGCs innerhalb eines Monats nach dem Verfahren, wenn die interne Kontrolle im Vergleich verloren. Dieses Verfahren ermöglicht die quantitative Analyse von Retinal Ganglion Zelltod in einem in vivo Rattenmodell Glaukoms.

Introduction

Glaukom ist eine Gruppe von Augenkrankheiten , Nervenzellen in der Netzhaut zu beeinflussen, insbesondere die retinalen Ganglionzellen ^1-2. Die Axone dieser Zellen konvergieren der Sehnerv visuelle Information tragenden zum Gehirn zu werden, wo die Sicht wahrgenommen wird. Schäden an RGCs und ihre Axone führt daher zu Sehfehler.

Die primären Merkmale im Zusammenhang mit Glaukom-Erkrankungen sind RGC Degeneration und Tod, erhöhter Augeninnendruck (IOP) und Papille Schröpfen und Atrophie. Diese Eigenschaften führen zu Gesichtsfeldausfällen oder vollständige, irreversible Blindheit. Derzeit hat ³ Blindheit in 70 Millionen Menschen weltweit Glaukom verursacht. Als solches ist es die drittgrößte Ursache für Erblindung ⁴ der Welt.

Der genaue Mechanismus der RGC Tod in Glaukom bleibt unbekannt. Viel Forschung wurde das Geheimnis zu entsperren getan. Es ist jedoch bekannt, dass der primäre Risikofaktor für Glaukom ist eine Zunahme in intraokularen Drucks aufgrund unregelmäßiger Zirkulation von wässrigem Humor (AH) in der Vorderkammer des Auges. AH dient als transparent und farblos Ersatz für Blut in der avaskulären Vorderkammer des Auges. Es nährt die umliegenden Zellen, entfernt sekretiertes Abfallprodukte aus Stoffwechselprozesse, transportiert Neurotransmitter und ermöglicht die Verbreitung von Drogen und Entzündungszellen innerhalb des Auges während der pathologischen Zustände ^1.

Die Aufrechterhaltung der wässrigen Humor Zirkulation beinhaltet die Ziliarkörper und das Trabekelwerk. Wässrige Humor wird durch den Ziliarkörper produziert. Es fließt dann in die vordere Kammer, die allgemeine Gesundheit des Augengewebes zu halten. 75-80% der wässrigen Abflusses wird aktiv durch nichtpigmentären Ciliarepithel sezerniert, wenn die Flüssigkeit durch drei Schichten des schwammigen Gewebe im Ziliarmuskel gefiltert wird. Das Fluid tritt durch das Trabekelwerk und durch den Schlemmschen Kanal, empties in das Blutsystem ⁵ .Die restlichen 20 – 25% der Abfluss umgeht das Trabekelwerk und wird passiv durch Ultrafiltration und Diffusion durch die uveo-skleralen Weg abgesondert. Dieser Weg scheint relativ unabhängig von den intraokularen Druck ¹ zu sein.

Wenn Kammerwasserproduktion und Abfluss aus dem Gleichgewicht geraten sind, baut den Druck im Auge. Wie bereits erwähnt, diese Erhöhung des intraokularen Drucks ist der primäre Risikofaktor bei der Entwicklung von Glaukom. Ein solcher Druck bewirkt, dass eine Beschädigung der komplizierten Schichten von Neuronen in der Netzhaut auf der Rückseite des Auges. Eine Schädigung der retinalen Ganglienzellen Axone des Sehnervs verursacht das Gehirn nicht mehr präzise visuelle Informationen zu erhalten. Als Ergebnis ist die Wahrnehmung des Sehvermögens verloren und vollständige Blindheit auftreten können.

Bis heute gibt es keine Heilung für Glaukom. Verschiedene Behandlungsmethoden gibt, die in erster Linie den intraokularen Druck zu reduzieren wollen. Dazu gehören die topischeMedikamente Klassen wie Beta1-Rezeptorenblocker oder topische Prostaglandin-Analoga. Betablocker reduzieren die intraokulare Druck durch die Produktion von Kammerwasser ⁷ abnimmt. Prostaglandine fungieren IOP zu reduzieren , indem der Abfluss von Humor aquosus ^8-14 erhöhen. Alpha-adrenergen Agonisten und Carboanhydrasehemmer sind auch als sekundäre Behandlungsmethoden verwendet werden. Alpha – adrenergen Agonisten erhöhen Abfluss durch den uveosklerale Weg ^15-17. Carboanhydrasehemmer reduzieren die Produktion von AH durch enzymatische Hemmung ^18. Viel mehr invasive Verfahren werden auch zur Behandlung von Glaukom verwendet wird. Lasertrabekuloplastik wird verwendet , ¹⁹ , um den Abfluss des Kammerwassers zu erhöhen. Eine weitere chirurgische Therapie, die so genannte Trabekulektomie schafft eine alternative Entwässerung Website AH zu filtern , wenn der traditionelle trabekulären Weg wird ^20-21 blockiert.

Diese Behandlungsoptionen wurden zu eff bekanntektiv IOP verringern. Jedoch bis zu 40% der Glaukompatienten für vollständigere therapeutischen Verfahren eine Notwendigkeit , den normalen IOP Ebenen zeigen anzeigt. ^22,23 Zusätzlich ist Retinal Ganglion Zelltod in Glaukom gesehen irreversible sobald es und aktuellen Behandlungen beginnt nicht das Fortschreiten der Krankheit zu stoppen ^24-28. Dies hat die Notwendigkeit einer wirksamen neuroprotektiven Therapien hervorgehoben, dass das Überleben der Neuronen selbst ausrichten. Entwicklung von Glaukom-Modelle ist für diese Entwicklung entscheidend.

In dieser Studie zeigen wir ein Verfahren zur Induzierung von Glaukom-ähnliche Effekte in erwachsenen Long Evans – Ratten mit einem modifizierten Verfahren unter Verwendung von ursprünglich umrissenen von Morrison ^29. In diesem Verfahren werden Injektionen von 2 M hypertonen Kochsalzlösung in dem episkleralen venösen Plexus induziert Glaukom ähnlichen Bedingungen durch Gewebe Vernarbung wässrigen Abflusses in das Trabekelwerk zu einem Anstieg des intraokularen Drucks und einem signifikanten Verlust an RGCs was zu reduzieren within eines Monats nach dem Verfahren ^30-31. Glaucoma-induzierenden Verfahren, wie das hier beschrieben ist, kann der Schlüssel zur Erschließung neuer Entwicklungen in Glaukombehandlung.

Protocol

Alle Verfahren tierischen Patienten verwendet haben in Übereinstimmung mit den Standards des Instituts für Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Western Michigan University. 1. Tiere Verwenden männlichen und weiblichen Ratten Alter von 3 Monaten in dieser Studie. Halten Sie Tiere in einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. 2. Herstellung von KAX Cocktail für Tier Anesthesia <…

Representative Results

Dieser Abschnitt stellt die Gerätekomponenten und Verfahren verwendet , um Glaukom ähnlichen Bedingungen in einem in vivo Ratten Glaukom Modell induzieren. Wir zeigen die einzelnen Werkzeuge und Geräte mit einer hypertonen Kochsalzlösung-Injektion auszuführen verwendet, die eine Erhöhung des intraokularen Druckes bewirkt. Wir zeigen die Injektion in den episkleralen venösen Plexus mit seinen charakteristischen Blanchierung Effekt und die trübes Aussehen der vorderen Kamm…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Glaukom-ähnlichen Bedingungen in einem in vivo Rattenmodell induzieren. Dieses Verfahren verwendet eine Injektion von hypertonischer Kochsalzlösung Vernarbung in das Trabekelwerk zu induzieren ^{29, 32.} Die Entwicklung Gewebenarben den Abfluss von Kammerwasser okkludiert , die Druck in der vorderen Kammer erhöht. Mit verminderten Abfluss und Druck aufzubauen, wird die Linse durch elastische Bänder suspendiert schiebt wieder in den Glaskörperraum. Vitre…

Materials

Xylazine hydrochloride, Minimum 99%	Sigma, Life Science	X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/mL	Putney, Inc	NDC 26637-411-01	10 mL bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/mL	Phoenix Pharmaceutical, Inc	NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408	50 mL bottle
Serum bottle, 10 mL	VWR	16171319	Borosilicate glass
1 mL insulin syringe	VWR	BD329410	28 gauge needle
Sodium chloride	Sigma	S7653	2 M Solution
Microelectrode Puller	Narishige Group	PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-10HP	without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes	World Precision Instruments, Inc	MF28G
18 gauge Luer-Lock needle	Fisher Scientific	1130421	Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing	Fisher Scientific	22046941	0.034 inch diameter, approximately 10 inches
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%	Akorn, Inc	NDC 17478-263-12	15 mL  sterile bottle
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-11
Microscope	Leica	StereoZoom 4
Hemostat Clamp	Fine Science Tools	1310912	curved edge
Triple Antibiotic Ointment	Fisher Scientific	NC0664481
Scalpel handle	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade # 11	Fine Science Tools	10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish	VWR	351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate	Sigma, Life Science	P7059-1L	1x dilution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Forceps (2), Dumont # 5	Fine Science Tools	11251-30
3 mL Transfer Pipets, polyethylene, non sterile	BD Biosciences	357524 or 52947-948	1 and 2 mL graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish	BD Biosciences	351008
Sylgard 184	VWR	102092-312
Cactus Needles	N/A	N/A
Paraformaldehyde	EMD Millipore	PX0055-3 or 818715.0100	Made into a 4% solution
Triton X-100	Sigma	T9284-100 mL	Made into both a 1% and 0.1% solution
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biological	S11150	500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1	BD Pharmingen	Cat 554892	1:300 dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11005	1:300 dilution
Microscope Slides	Corning	2948-75×25
Glycerol	Sigma	G5516-100 mL	50% glycerol to 50% PBS, by weight
Coverglass	Corning	2975-225	Thickness 1 22 x 50 mm
Confocal Microscope	Nikon	C2 Eclipse Ti