Глаукома индуцирующего процедуры в<em> В Vivo</em> Крыса модель и всего монтажа Retina Подготовка

Summary

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Abstract

Глаукома является заболеванием центральной нервной системы, затрагивающей ганглиозных клеток сетчатки (ГКС). RGC аксоны, составляющие зрительного нерва несут визуальный ввод в мозг для зрительного восприятия. Повреждение ГКС и их аксонов приводит к потере зрения и / или слепота. Хотя конкретная причина глаукомы неизвестна, основной фактор риска развития заболевания является повышенное внутриглазное давление. Глаукома индуцирующего процедуры на животных моделях являются ценным инструментом для исследователей, изучающих механизм смерти RGC. Такая информация может привести к разработке эффективных нейропротекторов лечения, которые могли бы помочь в предотвращении потери зрения. Протокол , используемый в данной статье описан способ индукции глаукомы – как в условиях в естественных условиях модели на крысах , где 50 мкл 2 М гипертонического раствора впрыскивается в Эписклеральные венозных сплетений. Побледнение сосудов свидетельствует об успешном окончании инъекции. Эта процедура приводит к потере ГКС для имитации глаукому. В течение месяца послеинъекции, животных умерщвляют и глаза не будут удалены. Далее, роговица, хрусталик, стекловидное тело и удаляются, чтобы сделать окуляр. Сетчатка затем отслаивается от задней части глаза и возлагали на Sylgard блюда с использованием кактус иглы. В этот момент, нейроны в сетчатке могут быть окрашены для анализа. Результаты этой лаборатории показывают, что примерно 25% РГК теряются в течение одного месяца после процедуры по сравнению с внутреннего контроля. Эта процедура позволяет для количественного анализа сетчатки смерти ганглиозных клеток в в естественных условиях модели глаукомы у крыс.

Introduction

Глаукома это группа глазных болезней , влияющих на нейроны в сетчатке, в частности, ганглиозных клеток сетчатки ^1-2. Аксоны этих клеток сходятся, чтобы стать зрительный нерв несущий визуальную информацию в мозг, где воспринимается видение. Повреждение ГКС и их аксонов поэтому вызывает визуальные дефекты.

Основные характеристики, связанные с нарушениями глаукомой являются ГКС вырождение и смерть, повышенное внутриглазное давление (ВГД) и оптический диск кровопускание и атрофии. Эти особенности приводят к потере зрения поля или полной, необратимой слепоте. В настоящее время глаукома привело к слепоте в 70 миллионов человек во всем мире ^3. Как таковой, он является третьим по величине причиной в мире слепоты ^4.

Точный механизм смерти RGC при глаукоме остается неизвестной. Много исследований было сделано, чтобы раскрыть тайну. Известно, однако, что основным фактором риска глаукомы является увеличение Iп внутриглазного давления из-за неправильной циркуляции внутриглазной жидкости (АГ) в передней камере глаза. AH действует в качестве прозрачного и бесцветного замены крови в лишенной сосудов передней камеры глаза. Она питает окружающие клетки, удаляет продукты жизнедеятельности из секретируемых обменных процессов, транспорта нейромедиаторов и позволяет циркуляцию лекарственных средств и воспалительных клеток в глаза при патологических состояниях ^1.

Поддержание водного циркуляции юмора вовлекает цилиарное тело и трабекулярной сети. Водные юмора производится цилиарного тела. Затем она поступает в переднюю камеру для поддержания общего состояния здоровья глазной ткани. 75 – 80% водного оттока юмор активно секретируются через не-пигментного эпителия цилиарного когда жидкость фильтруют через три слоя губчатой ​​ткани в цилиарной мышцы. Жидкость выходит через трабекулярной сети и через канал Schlemm, который упредитьх годов в кровеносную систему ⁵ .The остальные 20 – 25% оттока обходит трабекулярной сети и пассивно секретируется ультрафильтрации и диффузии через uveo-склеры пути. Этот путь , как представляется, относительно не зависит от внутриглазного давления ^1.

Когда водный юмор производство и отток из равновесия, нарастает давление внутри глаза. Как было указано, это увеличение внутриглазного давления является основным фактором риска в развитии глаукомы. Такое давление приводит к повреждению запутанных слоев нейронов в сетчатке в задней части глаза. Повреждение сетчатки ганглиозных клеток аксонов зрительного нерва заставляет мозг больше не получать точную визуальную информацию. В результате, восприятие зрения теряется и полная слепота может произойти.

На сегодняшний день, нет никакого лечения глаукомы. Различные методы лечения существуют, которые в первую очередь направлены на снижение внутриглазного давления. К ним относятся местноеКлассы препараты, такие как блокаторы рецепторов бета1-адренорецепторов или местного аналогов простагландинов. Бета – блокаторы снижают внутриглазное давление за счет уменьшения производства водянистой влаге ^7. Простагландины функции для снижения ВГД за счет увеличения оттока водянистой влаги ^8-14. Альфа-адренергические агонисты и ингибиторы карбоангидразы также используются в качестве вторичных методов лечения. Альфа – адренергические агонисты увеличивают отток через увеосклерального пути ^15-17. Ингибиторы карбоангидразы уменьшают выработку АГ путем ферментативного торможения ^18. Гораздо более инвазивных процедур, также используются для лечения глаукомы. Лазер трабекулопластика используется для увеличения оттока водянистой влаги ^19. Еще одна хирургическая терапия, называемая трабекулэктомия, создает альтернативный дренажный узел для фильтрации AH , когда традиционный трабекулярная путь заблокирован ^20-21.

Эти варианты лечения, как известно, эффectively снизить ВГД. Тем не менее, до 40% пациентов с глаукомой показывают нормальный уровень ВГД , указывающие на необходимость более полных терапевтических методов. ^22,23 Кроме того, смерть сетчатки ганглиозных клеток видно при глаукоме является необратимым , как только она начинается и современные методы лечения не останавливают прогрессирование заболевания ^24-28. Это подчеркивает необходимость принятия эффективных нейропротекторов терапии, которые нацелены на выживание самих нейронов. Разработка моделей глаукомой имеет решающее значение для этого развития.

В данном исследовании мы демонстрируем способ индукции глаукомы-подобных эффектов у взрослых крыс Long Evans с помощью модифицированной методики , описанной первоначально Моррисоном ^29. В этой процедуре, инъекции 2 М гипертонического раствора в Эписклеральные в венозных сплетений индуцирует Глаукома как условия рубцами ткани, чтобы уменьшить оттоку юмор в трабекулярной сети, приводящей к повышению внутриглазного давления и значительной потере ГКС шithin один месяц процедуры ^30-31. Глаукома индуцирующего процедуры, такие, как описанный здесь, может быть ключом к открытию новых разработок при глаукоме лечения.

Protocol

Все процедуры с использованием предметов животного происхождения были в соответствии со стандартами Института уходу и использованию животных комитета (IACUC) в Университете Западного Мичигана. 1. Животные Используйте самцов и самок крыс 3-месячного возраста в данно…

Representative Results

В этом разделе показаны компоненты оборудования и процедуры , используемые для индукции глаукомы подобных условиях в естественных условиях в модели глаукомы у крыс. Показано, отдельные инструменты и оборудование, используемые для выполнения гипертонического р?…

Discussion

Этот протокол описывает способ индукции глаукомы подобных условиях в естественных условиях в модели крысы. Эта процедура использует инъекцию гипертонического раствора , чтобы вызвать образование рубцов в трабекулярной сети ^{29, 32.} Развитие рубцовой ткани закупоривает отток?…

Materials

Xylazine hydrochloride, Minimum 99%	Sigma, Life Science	X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/mL	Putney, Inc	NDC 26637-411-01	10 mL bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/mL	Phoenix Pharmaceutical, Inc	NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408	50 mL bottle
Serum bottle, 10 mL	VWR	16171319	Borosilicate glass
1 mL insulin syringe	VWR	BD329410	28 gauge needle
Sodium chloride	Sigma	S7653	2 M Solution
Microelectrode Puller	Narishige Group	PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-10HP	without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes	World Precision Instruments, Inc	MF28G
18 gauge Luer-Lock needle	Fisher Scientific	1130421	Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing	Fisher Scientific	22046941	0.034 inch diameter, approximately 10 inches
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%	Akorn, Inc	NDC 17478-263-12	15 mL  sterile bottle
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-11
Microscope	Leica	StereoZoom 4
Hemostat Clamp	Fine Science Tools	1310912	curved edge
Triple Antibiotic Ointment	Fisher Scientific	NC0664481
Scalpel handle	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade # 11	Fine Science Tools	10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish	VWR	351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate	Sigma, Life Science	P7059-1L	1x dilution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Forceps (2), Dumont # 5	Fine Science Tools	11251-30
3 mL Transfer Pipets, polyethylene, non sterile	BD Biosciences	357524 or 52947-948	1 and 2 mL graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish	BD Biosciences	351008
Sylgard 184	VWR	102092-312
Cactus Needles	N/A	N/A
Paraformaldehyde	EMD Millipore	PX0055-3 or 818715.0100	Made into a 4% solution
Triton X-100	Sigma	T9284-100 mL	Made into both a 1% and 0.1% solution
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biological	S11150	500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1	BD Pharmingen	Cat 554892	1:300 dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11005	1:300 dilution
Microscope Slides	Corning	2948-75×25
Glycerol	Sigma	G5516-100 mL	50% glycerol to 50% PBS, by weight
Coverglass	Corning	2975-225	Thickness 1 22 x 50 mm
Confocal Microscope	Nikon	C2 Eclipse Ti