녹내장 유도 절차<em> 생체</em> 쥐 모델 및 전체 마운트 망막 준비
Summary
Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.
Abstract
녹내장은 망막 신경절 세포 (망막 신경절 세포)에 영향 중추 신경계 질환이다. 시신경을 구성하는 RGC 축삭은 시각적 인식에 대한 뇌 영상 입력을 수행한다. 망막 신경절 세포 및 축삭 손상은 시력 상실 및 / 또는 실명에 이르게. 녹내장의 특정 원인 불명이지만, 병의 주 위험 인자 안압 상승이다. 동물 모델에서 녹내장 유발 절차는 RGC 죽음의 메커니즘을 공부하는 연구자들에게 유용한 도구입니다. 이러한 정보는 시력 상실의 예방에 도움이 있었다 효과적인 신경 보호 치료제의 개발로 이어질 수있다. 2 M 고장 성 식염수 50 μL가 상공 막 정맥총 주입되는 생체 래트 모델에서와 같은 조건 -이 문서에서 프로토콜 녹내장을 유도하는 방법을 설명한다. 선박의 창백 성공적인 주사를 나타냅니다. 이 절차는 녹내장을 시뮬레이션하는 망막 신경절 세포의 손실이 발생합니다. 다음 한 달주입, 동물 희생하고 눈은 제거됩니다. 다음으로, 각막, 렌즈, 유리체는 아이 컵을 제거한다. 망막은 안구의이면으로부터 박리 선인장 바늘을 사용하여 실 가드 접시에 고정된다. 이 시점에서, 망막 신경 세포 분석을 위해 염색 할 수있다. 이 실험의 결과는 내부 통제에 비해 망막 신경절 세포의 약 25 %가 절차의 1 개월 이내에 손실 된 것으로 나타났다. 이 절차는 생체 녹내장 래트 모델의 망막 신경절 세포 사멸의 정량 분석을 허용한다.
Introduction
녹내장은 구체적으로는, 망막 신경절 세포 1-2, 망막 신경 세포에 영향을 눈 질환 군이다. 이러한 세포의 축삭 비전 인식되고 뇌에 시각 정보를 전달하는 시신경 될 모이다. 망막 신경절 세포 및 축삭 손상 때문에 시각적 결함을 발생합니다.
녹내장 질환과 관련된 주요 특성은 RGC 변성과 죽음, 증가 된 안압 (IOP), 및 광학 디스크 부항과 위축이다. 이러한 기능은 시야 손실 또는 전체, 돌이킬 수없는 시력 상실로 이어집니다. 현재 녹내장은 전 세계적으로 7천만명 3 실명가 발생했습니다. 따라서, 그것은 실명 (4)의 세계에서 세 번째로 큰 원인이다.
녹내장의 RGC 죽음의 정확한 메커니즘은 알 수없는 남아 있습니다. 많은 연구는 신비의 잠금을 해제하기 위해 수행되었다. 녹내장의 주요 위험 인자는 증가 나는 것을 그러나 알려져때문에 눈의 전방에서 수성 유머 (AH)의 불규칙한 순환에 n 개의 안압. AH는 눈의 무혈성 전방에 혈액 투명하고 무색의 대체 역할을합니다. 또한, 주변 셀 영양 대사 과정에서 분비 노폐물을 제거하고, 신경 전달 물질을 수송 및 병적 상태 일 동안 약물과 안구 내 염증 세포의 순환을 허용한다.
방수 순환의 유지 보수는 모양체와 섬유주을 포함한다. 방수는 모양체에 의해 생성된다. 그러므로 안구 조직의 전반적인 건강을 유지하기 위해 전방으로 흐른다. (75) – 유체가 모양체 근육의 해면 조직의 세 가지 레이어를 통해 여과 될 때 방수 유출의 80 %는 적극적으로 비 안료 섬모 상피를 통해 분비된다. 섬유주를 통해 어느 EMPT Schlemm의 운하를 통해 유체 종료(20)에 남아있는 혈액 계 5 국지적으로 이거 – 유출의 25 %는 섬유주를 무시하고 수동적으로 uveo – 공막 경로를 통해 한외 여과 및 확산에 의해 분비된다. 이 경로는 안압 1의 비교적 독립적으로 나타납니다.
방수의 생산과 유출이 균형을 때, 압력은 눈에서 작성합니다. 언급 한 바와 같이, 안압의 증가는 녹내장의 개발에 주요 위험 인자이다. 이러한 압력은 눈 뒤쪽의 망막 신경 세포의 복잡한 층에 손상을 야기한다. 시신경의 망막 신경절 세포의 축삭 손상은 더 이상 정확한 시각 정보를 수신하지 않으려면 뇌가 발생합니다. 그 결과, 시각 인식이 손실되고 완전한 실명이 발생할 수있다.
현재까지 녹내장에 대한 치료가 없습니다. 다른 처리 방법은 주로 안압을 감소시키는 것을 목표로 존재한다. 이러한 국소 포함이러한 베타 – 아드레날린 수용체 차단제, 또는 국소 프로스타글란딘 유사체와 같은 약물 클래스. 베타 차단제는 방수 (7)의 생산을 감소시켜 안압을 감소시킨다. 프로스타글란딘은 방수 8-14의 유출을 증가시킴으로써 IOP를 감소시키는 기능을한다. 알파 아드레날린 성 작용제 및 탄산 탈수 효소 저해제는 또한 보조 치료 방법으로 사용된다. 알파 아드레날린 작용제는 uveoscleral 경로 15-17을 통해 유출을 증가시킨다. 탄산 탈수 효소 저해제는 효소 저해 18 AH의 생산을 감소시킨다. 훨씬 더 침습적 절차는 녹내장을 치료하는 데 사용하고있다. 레이저 섬유주은 방수 (19)의 유출을 증가시키기 위해 사용된다. 섬유주 절제술이라는 또 다른 수술 치료, 전통 소주 경로가 20-21 차단 될 때 AH를 필터링 할 수있는 대안 배수 사이트를 만듭니다.
이러한 치료 방법은 EFF 것으로 알려져ectively 안압을 감소시킨다. 그러나, 녹내장 환자의 40 %가 더 완전한 치료 방법에 대한 필요성을 나타내는 정상 IOP 레벨을 나타낸다. (22, 23)는 또한 그것의 시작과 현재 치료 질환의 진행을 중지하지 일단 녹내장 볼 망막 신경절 세포의 사멸은 비가역 24-28. 이 뉴런 자체의 생존을 타겟팅 효과적인 신경 치료에 대한 필요성을 강조하고있다. 녹내장 모델의 개발이 개발에 매우 중요합니다.
본 연구에서 우리는 원래 모리슨 (29)에 의해 설명 된 절차를 사용하여 변형 성인 긴 에반스 쥐들 녹내장과 같은 효과를 유도하는 방법을 설명한다. 이 과정에서, 상공 막 정맥총에 2 M 고장 성 식염수 주사 안압의 증가 및 망막 신경절 세포의 상당한 손실 w 선도 섬유주에 방수 유출을 줄이기 위해 조직 흉터 녹내장과 같은 조건을 유도절차 30-31 한 달 ithin. 이러한 여기에 설명 된 것과 녹내장 유발 절차, 녹내장 치료의 새로운 발전을 잠금 해제의 열쇠가 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 생체 내 쥐 모델에서 녹내장과 같은 조건을 유도하는 방법을 설명한다. 이 절차는 29, 32. 흉터 조직을 개발하는 것은 전방에 압력을 증가 방수의 유출 폐색 섬유주에 흉터를 유발하는 고장 성 식염수 주사를 사용합니다. 감소 유출 및 압력 구축으로, 탄성 인대에 의해 중단 렌즈 다시 유리체 챔버로 푸시합니다. 유리체 유머는 깨지기 쉬운 망막 신경 세포의 손상을 망?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C. Linn is supported by an NIH grant (NIH NEI EY022795).
Materials
| Xylazine hydrochloride, Minimum 99% | Sigma, Life Science | X1251-1G | |
| Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/mL | Putney, Inc | NDC 26637-411-01 | 10 mL bottle |
| Acepromazine Maleate, 10mg/mL | Phoenix Pharmaceutical, Inc | NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408 | 50 mL bottle |
| Serum bottle, 10 mL | VWR | 16171319 | Borosilicate glass |
| 1 mL insulin syringe | VWR | BD329410 | 28 gauge needle |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | 2 M Solution |
| Microelectrode Puller | Narishige Group | PP-830 | |
| Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-86-10HP | without filament, 0.86 mm |
| Microfil syringe needle for filling micropipettes | World Precision Instruments, Inc | MF28G | |
| 18 gauge Luer-Lock needle | Fisher Scientific | 1130421 | Syringe needle |
| Flexible Polyethylene Tubing | Fisher Scientific | 22046941 | 0.034 inch diameter, approximately 10 inches |
| Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5% | Akorn, Inc | NDC 17478-263-12 | 15 mL sterile bottle |
| Curved Scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Microscope | Leica | StereoZoom 4 | |
| Hemostat Clamp | Fine Science Tools | 1310912 | curved edge |
| Triple Antibiotic Ointment | Fisher Scientific | NC0664481 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade # 11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| 60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish | VWR | 351007 | |
| Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate | Sigma, Life Science | P7059-1L | 1x dilution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Forceps (2), Dumont # 5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| 3 mL Transfer Pipets, polyethylene, non sterile | BD Biosciences | 357524 or 52947-948 | 1 and 2 mL graduations |
| 35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish | BD Biosciences | 351008 | |
| Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
| Cactus Needles | N/A | N/A | |
| Paraformaldehyde | EMD Millipore | PX0055-3 or 818715.0100 | Made into a 4% solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100 mL | Made into both a 1% and 0.1% solution |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biological | S11150 | 500 ml |
| Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1 | BD Pharmingen | Cat 554892 | 1:300 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11005 | 1:300 dilution |
| Microscope Slides | Corning | 2948-75×25 | |
| Glycerol | Sigma | G5516-100 mL | 50% glycerol to 50% PBS, by weight |
| Coverglass | Corning | 2975-225 | Thickness 1 22 x 50 mm |
| Confocal Microscope | Nikon | C2 Eclipse Ti |
Riferimenti
- Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous Humor Dynamics: A Review. Open Ophthalmol. J. 4, 52-59 (2010).
- Thylefors, B., Negrel, A. D. The global impact of glaucoma. Bull. World Health Organ. 72 (3), 323-326 (1994).
- Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bull. World Health Organ. 73 (1), 115-121 (1995).
- Roodhooft, J. M. Leading causes of blindness worldwide. Bull Soc. Belge. Ophtalmol. 283, 19-25 (2002).
- Sacca, S., Pulliero, A., Izzotti, A. The Dysfunction of the Trabecular Meshwork During Glaucoma Course. J. Cell. Physiol. 230 (3), 510-525 (2014).
- McKinnon, S. J., Goldberg, L. D., Peeple, P., Walt, J. G., Bramley, T. J. Current Management of Glaucoma and the Need for Complete Therapy. Am. J. Manag. Care. 14 (1 Suppl), S20-S27 (2008).
- Lee, D. A., Higginbotham, E. J. Glaucoma and its treatment: a review. Am. J. Health Syst. Pharm. 62, 691-699 (2005).
- Brandt, J. D., Vandenburgh, A. M., Chen, K., Whitcup, S. M. Bimatoprost Study Group. Comparison of once- or twice-daily bimatoprost with twice-daily timolol in patients with elevated IOP: a 3-month clinical trial. Ophthalmology. 108, 1023-1031 (2001).
- Camras, C. B. Comparison of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension and glaucoma: a six-month masked, multicenter trial in the United States. The United States Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 138-147 (1996).
- Netland, P. A., et al. Travoprost compared with latanoprost and timolol in patients with open-angle glaucoma or ocular hypertension. Am. J. Ophthalmol. 132, 472-484 (2001).
- Sherwood, M., Brandt, J. Bimatoprost Study Groups 1 and 2. Six-month comparison of bimatoprost once-daily and twice-daily with timolol twice-daily in patients with elevated intraocular pressure. Surv. Ophthalmol. 45 (Suppl 4), S361-S368 (2001).
- Watson, P., Stjernschantz, J. A six-month, randomized, double-masked study comparing latanoprost with timolol in open-angle glaucoma and ocular hypertension. The Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 126-137 (1996).
- Hedman, K., Alm, A., Gross, R. L. Pooled-data analysis of three randomized double-masked, six-month studies comparing intraocular pressure-reducing effects of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension. J. Glaucoma. 12 (6), 463-465 (2003).
- Schumer, R. A., Podos, S. M. The nerve of glaucoma!. Arch. Ophthalmol. 112, 37-44 (1994).
- Tsai, J. C., Chang, H. W. Comparison of the effects of brimonidine 0.2% and timolol 0.5% on retinal nerve fiber layer thickness in ocular hypertensive patients: a prospective, unmasked study. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 21 (6), 475-482 (2005).
- Wilhelm, B., Ludtke, H., Wilhelm, H. The BRAION Study Group. Efficacy and tolerability of 0.2% brimonidine tartrate for the treatment of acute non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION): a 3-month, double-masked, randomised, placebo-controlled trial. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 244, 551-558 (2006).
- Fazzone, H. E., Kupersmith, M. J., Leibmann, J. Does topical brimonidine tartrate help NAION?. Br. J. Ophthalmol. 87, 1193-1194 (2003).
- Harris, A., Arend, O., Kagemann, L., Garrett, M., Chung, H. S., Martin, B. Dorzolamide, visual function and ocular hemodynamics in normal-tension glaucoma. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 15, 189-197 (1999).
- Leahy, K. E., White, A. J. Selective laser trabeculoplasty: current perspectives. Clin. Ophthalmol. 11 (9), 833-841 (2015).
- Nesaratnam, N., Sarkies, N., Martin, K. R., Shahid, H. Pre-operative intraocular pressure does not influence outcome of trabeculectomy surgery: a retrospective cohort study. BMC Ophthalmol. 15 (1), 17 (2015).
- Cairns, J. E. Trabeculectomy. Preliminary report of a new method. Am. J. Ophthalmol. 66 (4), 673-679 (1968).
- Cheng, J. W., Cai, J. P., Wei, R. L. Meta-analysis of medical intervention for normal tension glaucoma. Ophthalomology. 116 (7), 1243-1249 (2009).
- Dielmans, I., Vingerling, J. R., Wolfs, R. C. W., Hofman, A., Grobbee, D. E., deJong, P. T. V. M. The prevalence of primary open-angle glaucoma in a population based study in The Netherlands: the Rotterdam Study. Ophthalmology. 101, 1851-1855 (1994).
- Lichter, P. R., et al. Interim clinical outcomes in the Collaborative Initial Glaucoma Treatment Study comparing initial treatment randomized to medications or surgery. Ophthalmology. 108 (11), 1943-1953 (2001).
- Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Arch. Ophthalmol. 120 (10), 1268-1279 (2002).
- Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Arch. Ophthalmol. 120 (6), 701-713 (2002).
- Beidoe, G., Mousa, S. A. Current primary open-angle glaucoma treatments and future directions. Clin. Ophthalmol. 6, 1699-1707 (2012).
- Jeong, J. H., Park, K. H., Jeoung, J. W., Kim, D. M. Preperimetric normal tension glaucoma study: long-term clinical course and effect of therapeutic lowering of intraocular pressure. Acta. Ophthalmol. 92 (3), e185-e193 (2014).
- Morrison, J. C., Moore, C. G., Deppmeier, L. M., Gold, B. G., Meshul, C. K., Johnson, E. C. A Rat Model of Chronic Pressure-Induced Optic Nerve Damage. Exp. Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).
- Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. Rat Models for Glaucoma Research. Prog. Brain Res. 173, 285-301 (2008).
- Iwamoto, K., Birkholz, P., Schipper, A., Mata, D., Linn, D. M., Linn, C. L. A Nicotinic Acetylcholine Receptor Agonist Prevents Loss of Retinal Ganglion Cells in a Glaucoma Model. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (2), 1078-1087 (2014).
- Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G. Limbal Microvasculature of the Rat Eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36 (3), 751-756 (1995).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse Models of Retinal Ganglion Cell Death and Glaucoma. Exp. Eye Res. 88 (4), 816-824 (2009).
- Maass, A., et al. Assessment of Rat and Mouse RGC Apoptosis Imaging in Vivo with Different Scanning Laser Ophthalmoscopes. Curr. Eye Res. 32 (10), 851-861 (2007).
- Li, Y., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Experimental induction of retinal ganglion cell death in adult mice. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 40 (5), 1004-1008 (1999).
- Gross, R. L., et al. A mouse model of elevated intraocular pressure: retina and optic nerve findings. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 101, 163-171 (2003).
- Cenni, M. C., Bonfanti, L., Martinou, J. C., Ratto, G. M., Strettoi, E., Maffei, L. Long-term survival of retinal ganglion cells following optic nerve section in adult bcl-2 transgenic mice. Eur. J. Neurosci. 8 (8), 1735-1745 (1996).
- Templeton, J. P., Geisert, E. E. A practical approach to optic nerve crush in the mouse. Mol. Vis. 18, 2147-2152 (2012).
- Schlamp, C. L., Johnson, E. C., Li, Y., Morrison, J. C., Nickells, R. W. Changes in Thy1 gene expression associated with damaged retinal ganglion cells. Mol. Vis. 7, 192-201 (2001).
- Libby, R. T., et al. Susceptibility to neurodegeneration in a glaucoma is modified by Bax gene dosage. PLoS Genet. 1, 17-26 (2005).
- Yang, Z., et al. Changes in gene expression in experimental glaucoma and optic nerve transection: the equilibrium between protective and detrimental mechanisms. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (12), 5539-5548 (2007).
- Huang, W., Fileta, J., Guo, Y., Grosskreutz, C. L. Downregulation of Thy1 in retinal ganglion cells in experimental glaucoma. Curr. Eye Res. 31 (3), 265-271 (2006).
- Smedowski, A., Pietrucha-Dutczak, M., Kaarniranta, K., Lewin-Kowalik, J. A rat experimental model of glaucoma incorporating rapid-onset elevation of intraocular pressure. Sci. Rep. 4, 1-11 (2014).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Exp. Eye Res. 91 (3), 415-424 (2010).
- Pease, M. E., Cone, F. E., Gelman, S., Son, J. L., Quigley, H. A. Calibration of the TonoLab tonometer in mice with spontaneous or experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (2), 858-864 (2011).
- Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 99, 27-35 (2012).
- Frankfort, B. J., et al. Elevated intraocular pressure causes inner retinal dysfunction before cell loss in a mouse model of experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (1), 762-770 (2013).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53 (7), 3847-3857 (2012).
- Cone-Kimball, E., et al. Scleral structural alterations associated with chronic experimental intraocular pressure elevation in mice. Mol. Vis. 19, 2023-2039 (2013).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).
- WoldeMussie, E., Ruiz, G., Wijono, M., Wheeler, L. A. Neuroprotection of retinal ganglion cells by brimonidine in rats with laser-induced chronic ocular hypertension. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42 (12), 2849-2855 (2001).
- Garcia-Valenzuela, E., Shareef, S., Walsh, J., Sharma, S. C. Programmed cell death of retinal ganglion cells during experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 61 (1), 33-44 (1995).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Experimental mouse ocular hypertension: establishment of the model. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (10), 4314-4320 (2003).
- Ji, J., et al. Effects of elevated intraocular pressure on mouse retinal ganglion cells. Vision Res. 45 (2), 169-179 (2005).
- Flammer, J., et al. The eye and the heart. Eur. Heart J. 34 (17), 1270-1278 (2013).
- Gugleta, K., et al. Association between risk factors and glaucomatous damage in untreated primary open-angle glaucoma. J. Glaucoma. 22 (6), 501-505 (2013).
- Mozaffarieh, M., Flammer, J. New insights in the pathogenesis and treatment of normal tension glaucoma. Curr. Opin. Pharmacol. 13 (1), 43-49 (2013).
