Glokom uyaran bir de Prosedürü<em> İn Vivo</em> Rat Modeli ve Tüm montaj Retina Hazırlık
Summary
Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.
Abstract
Glokom, retinal bez hücrelerin (RGCs) etki eden, merkezi sinir sisteminin bir hastalığıdır. optik sinir oluşturan RGC aksonlar görsel algı için beyne görsel girdi taşırlar. RGCs ve akson hasar görme kaybı ve / veya körlüğe yol açar. glokom spesifik nedeni bilinmemekle birlikte, hastalığın birincil risk faktörü yüksek bir göz içi basıncı. hayvan modellerinde Glokom uyaran prosedürler RGC ölüm mekanizmasını çalışan araştırmacılar için değerli bir araçtır. Bu tür bilgiler görme kaybının önlenmesinde yardımcı olabilir etkili bir nöro-koruyucu tedavilerin geliştirilmesine yol açabilir. 2 M hipertonik salin 50 ul episkleral venöz pleksus enjekte edilir, bir in vivo sıçan modelinde koşulları gibi – bu yazıda protokolü glokom teşvik etmek için bir yöntem tarif eder. damarların Ağartma başarılı bir enjeksiyon gösterir. Bu prosedür glokom simüle etmek için RGCs kaybına neden olur. takip eden bir ayenjeksiyonu, hayvanlar kurban edilmiş ve gözler uzaklaştırılır. Sonraki, kornea, lens ve vitreus bir göz yuvasını yapmak için kaldırılır. Retina sonra gözün arka soyulmuş ve kaktüs iğneler kullanılarak Sylgard yemekleri üzerine tutturulmuş. Bu noktada, retina nöronlarının analizi için boyandı. Bu laboratuvarda elde edilen sonuçlar iç kontroller ile karşılaştırıldığında RGCs yaklaşık% 25'i prosedürü bir ay içinde kaybolur olduğunu göstermektedir. Bu prosedür, bir in vivo sıçan glokom modelinde retinal ganglion hücresi ölümü kantitatif analizi sağlar.
Introduction
Glokom özel olarak ise, retinal ganglion hücre 1-2, retina nöronlarını etkileyenler göz hastalıklarının grubudur. Bu hücrelerin aksonları vizyon algılanan beyine görsel bilgileri taşıyan optik sinir olmaya birleşir. RGCs ve akson hasar dolayısıyla görsel kusurları neden olur.
glokom bozuklukları ile ilişkili birincil özellikler RGC dejenerasyonu ve ölümü, artan göz içi basıncı (GİB) ve optik diskin çukurluğu ve atrofi vardır. Bu özellikler görme alanı kaybı ya da tam geri dönüşü olmayan körlüğe yol açar. Şu anda, glokom, dünya çapında 70 milyon insanın 3 körlük neden olmuştur. Bunun gibi, körlük 4 dünyanın en büyük üçüncü nedenidir.
Glokom RGC kesin ölüm mekanizması bilinmemektedir. Çok araştırma gizem kilidini açmak için yapılmıştır. Glokom birincil risk faktörü bir artış i Bununla birlikte, bilinennedeniyle gözün ön kamarasında sulu mizah (AH) düzensiz dolaşımına n göz içi basıncı. AH gözün avasküler ön kamara kan saydam ve renksiz bir yedek olarak işlev görür. Bu, çevredeki hücreleri besler metabolik süreçler salgılanan atık ürünler kaldırır, nörotransmitter nakil ve patolojik devletlerin 1 sırasında uyuşturucu ve gözün içinde inflamatuar hücrelerin dolaşımını sağlar.
Sulu mizah dolaşım bakım siliyer cisim ve trabeküler ağı içerir. Sulu mizah siliyer cisim tarafından üretilir. Daha sonra göz dokusunun genel sağlığını korumak için ön kamaraya akar. 75 – Sıvı siliyer kasta süngerimsi doku üç katmandan süzülür zaman sulu mizah çıkışı% 80 aktif olmayan pigment siliyer epitel içinden salgılanır. trabeküler ağ yoluyla ve hangi satınalmada öncelikli Schlemm Kanalı aracılığıyla sıvı çıkar20 Kalan kan sistemi 5 hayranlarıyla içine ler – çıkışı% 25 trabeküler ağı atlar ve pasif uveo-skleral yolu ile ultrafiltrasyon ve difüzyon tarafından salgılanır. Bu yol göz içi basıncı 1 nispeten bağımsız olduğu görülmektedir.
aköz üretimi ve çıkış dengesi olduğunda, basınç gözün içindeki kurar. Belirtildiği gibi, göz içi basıncının bu artış glokom gelişiminde en önemli risk faktörüdür. Bu baskı, gözün arkasındaki retina nöronlarının karmaşık tabakalar hasara neden olur. optik sinir retina ganglion hücre aksonları hasar artık doğru bir görsel bilgi almak için beyin neden olur. Bunun bir sonucu olarak, görüş algılama kaybolur ve tam körlük olabilir.
Bugüne kadar, glokom için tedavisi yoktur. Farklı tedavi yöntemleri öncelikle göz içi basıncını azaltmak amacı vardır. Bu harici,Bu beta1-adrenerjik reseptör blokerleri, ya da topik prostaglandin analogları olarak ilaç sınıfları. Beta blokerler sulu mizah 7 üretimini azaltarak göz içi basıncını azaltır. Prostaglandinler sulu mizah 8-14 akışını artırarak GİB'in azaltmak için çalışır. Alfa adrenerjik agonistler, karbonik anhidraz inhibitörleri, aynı zamanda tedavi ikincil yöntem olarak kullanılmaktadır. Alfa adrenerjik agonistler uveoskleral yolunun 15-17 ile çıkışı artar. Karbonik anhidraz inhibitörleri enzimatik inhibisyon 18 ile AH üretimini azaltır. Çok daha invaziv girişimler aynı zamanda glokom tedavisinde kullanılmaktadır. Lazer trabeküloplasti sulu mizah 19 çıkış artırmak için kullanılır. Trabekülektomi adlı başka bir cerrahi tedavi, geleneksel trabeküler yolu 20-21 bloke olduğunda AH filtrelemek için alternatif bir drenaj sitesi oluşturur.
Bu tedavi seçenekleri eff bilinmektedirectively Göz içi basıncını düşürmek. Ancak, glokom hastalarının% 40'a varan daha tam tedavi yöntemleri için bir ihtiyaç gösteren, normal GİB göstermektedir. 22,23 Ek olarak başlar ve güncel tedaviler hastalığın ilerlemesini bitmiyor kez glokom görülen retina ganglion hücre ölümü geri döndürülemez 24-28. Bu nöronların kendilerini hayatta hedefleyen etkili nöroprotektif tedaviler gerekliliğini göstermiştir. glokom modellerinin geliştirilmesi, bu gelişimi için çok önemlidir.
Bu çalışmada, ilk olarak Morrison 29 ile belirtilen bir tadil edilmiş bir prosedür kullanılarak, yetişkin Long Evans sıçanlarda glokom gibi etkileri başlatmak için bir yöntem gösteriyorlar. Bu prosedürde, episkleral venöz pleksus içine 2 M hipertonik salin enjeksiyonları göz içi basınç artışı ve RGCs önemli bir kayıp w yol açan trabeküler ağda sulu mizah çıkışı azaltmak için doku yara izi ile glokom gibi koşullar indüklerprosedür 30-31 bir ay ithin. Böyle Burada anlatılan biri olarak Glokom uyaran prosedürleri, glokom tedavisinde yeni gelişmeler çözmenin anahtarı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, bir in vivo sıçan modelinde glokom gibi koşulların oluşturulması için bir yöntem tarif eder. Bu prosedür 29, 32. Skar dokusu geliştirilmesi ön kamarada basıncı artar sulu mizah çıkışı tıkar trabeküler ağda yara izi ikna etmek için hipertonik salin enjeksiyonu kullanır. azalmış çıkış ve basınç kurmak ile, elastik ligaman tarafından askıya objektif geri vitreus odasına iter. Vitreus mizah sonra kırılgan retina nöronlar zarar retina üzerine basınç uyg…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C. Linn is supported by an NIH grant (NIH NEI EY022795).
Materials
| Xylazine hydrochloride, Minimum 99% | Sigma, Life Science | X1251-1G | |
| Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/mL | Putney, Inc | NDC 26637-411-01 | 10 mL bottle |
| Acepromazine Maleate, 10mg/mL | Phoenix Pharmaceutical, Inc | NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408 | 50 mL bottle |
| Serum bottle, 10 mL | VWR | 16171319 | Borosilicate glass |
| 1 mL insulin syringe | VWR | BD329410 | 28 gauge needle |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | 2 M Solution |
| Microelectrode Puller | Narishige Group | PP-830 | |
| Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-86-10HP | without filament, 0.86 mm |
| Microfil syringe needle for filling micropipettes | World Precision Instruments, Inc | MF28G | |
| 18 gauge Luer-Lock needle | Fisher Scientific | 1130421 | Syringe needle |
| Flexible Polyethylene Tubing | Fisher Scientific | 22046941 | 0.034 inch diameter, approximately 10 inches |
| Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5% | Akorn, Inc | NDC 17478-263-12 | 15 mL sterile bottle |
| Curved Scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Microscope | Leica | StereoZoom 4 | |
| Hemostat Clamp | Fine Science Tools | 1310912 | curved edge |
| Triple Antibiotic Ointment | Fisher Scientific | NC0664481 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade # 11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| 60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish | VWR | 351007 | |
| Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate | Sigma, Life Science | P7059-1L | 1x dilution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Forceps (2), Dumont # 5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| 3 mL Transfer Pipets, polyethylene, non sterile | BD Biosciences | 357524 or 52947-948 | 1 and 2 mL graduations |
| 35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish | BD Biosciences | 351008 | |
| Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
| Cactus Needles | N/A | N/A | |
| Paraformaldehyde | EMD Millipore | PX0055-3 or 818715.0100 | Made into a 4% solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100 mL | Made into both a 1% and 0.1% solution |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biological | S11150 | 500 ml |
| Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1 | BD Pharmingen | Cat 554892 | 1:300 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11005 | 1:300 dilution |
| Microscope Slides | Corning | 2948-75×25 | |
| Glycerol | Sigma | G5516-100 mL | 50% glycerol to 50% PBS, by weight |
| Coverglass | Corning | 2975-225 | Thickness 1 22 x 50 mm |
| Confocal Microscope | Nikon | C2 Eclipse Ti |
Riferimenti
- Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous Humor Dynamics: A Review. Open Ophthalmol. J. 4, 52-59 (2010).
- Thylefors, B., Negrel, A. D. The global impact of glaucoma. Bull. World Health Organ. 72 (3), 323-326 (1994).
- Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bull. World Health Organ. 73 (1), 115-121 (1995).
- Roodhooft, J. M. Leading causes of blindness worldwide. Bull Soc. Belge. Ophtalmol. 283, 19-25 (2002).
- Sacca, S., Pulliero, A., Izzotti, A. The Dysfunction of the Trabecular Meshwork During Glaucoma Course. J. Cell. Physiol. 230 (3), 510-525 (2014).
- McKinnon, S. J., Goldberg, L. D., Peeple, P., Walt, J. G., Bramley, T. J. Current Management of Glaucoma and the Need for Complete Therapy. Am. J. Manag. Care. 14 (1 Suppl), S20-S27 (2008).
- Lee, D. A., Higginbotham, E. J. Glaucoma and its treatment: a review. Am. J. Health Syst. Pharm. 62, 691-699 (2005).
- Brandt, J. D., Vandenburgh, A. M., Chen, K., Whitcup, S. M. Bimatoprost Study Group. Comparison of once- or twice-daily bimatoprost with twice-daily timolol in patients with elevated IOP: a 3-month clinical trial. Ophthalmology. 108, 1023-1031 (2001).
- Camras, C. B. Comparison of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension and glaucoma: a six-month masked, multicenter trial in the United States. The United States Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 138-147 (1996).
- Netland, P. A., et al. Travoprost compared with latanoprost and timolol in patients with open-angle glaucoma or ocular hypertension. Am. J. Ophthalmol. 132, 472-484 (2001).
- Sherwood, M., Brandt, J. Bimatoprost Study Groups 1 and 2. Six-month comparison of bimatoprost once-daily and twice-daily with timolol twice-daily in patients with elevated intraocular pressure. Surv. Ophthalmol. 45 (Suppl 4), S361-S368 (2001).
- Watson, P., Stjernschantz, J. A six-month, randomized, double-masked study comparing latanoprost with timolol in open-angle glaucoma and ocular hypertension. The Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 126-137 (1996).
- Hedman, K., Alm, A., Gross, R. L. Pooled-data analysis of three randomized double-masked, six-month studies comparing intraocular pressure-reducing effects of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension. J. Glaucoma. 12 (6), 463-465 (2003).
- Schumer, R. A., Podos, S. M. The nerve of glaucoma!. Arch. Ophthalmol. 112, 37-44 (1994).
- Tsai, J. C., Chang, H. W. Comparison of the effects of brimonidine 0.2% and timolol 0.5% on retinal nerve fiber layer thickness in ocular hypertensive patients: a prospective, unmasked study. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 21 (6), 475-482 (2005).
- Wilhelm, B., Ludtke, H., Wilhelm, H. The BRAION Study Group. Efficacy and tolerability of 0.2% brimonidine tartrate for the treatment of acute non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION): a 3-month, double-masked, randomised, placebo-controlled trial. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 244, 551-558 (2006).
- Fazzone, H. E., Kupersmith, M. J., Leibmann, J. Does topical brimonidine tartrate help NAION?. Br. J. Ophthalmol. 87, 1193-1194 (2003).
- Harris, A., Arend, O., Kagemann, L., Garrett, M., Chung, H. S., Martin, B. Dorzolamide, visual function and ocular hemodynamics in normal-tension glaucoma. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 15, 189-197 (1999).
- Leahy, K. E., White, A. J. Selective laser trabeculoplasty: current perspectives. Clin. Ophthalmol. 11 (9), 833-841 (2015).
- Nesaratnam, N., Sarkies, N., Martin, K. R., Shahid, H. Pre-operative intraocular pressure does not influence outcome of trabeculectomy surgery: a retrospective cohort study. BMC Ophthalmol. 15 (1), 17 (2015).
- Cairns, J. E. Trabeculectomy. Preliminary report of a new method. Am. J. Ophthalmol. 66 (4), 673-679 (1968).
- Cheng, J. W., Cai, J. P., Wei, R. L. Meta-analysis of medical intervention for normal tension glaucoma. Ophthalomology. 116 (7), 1243-1249 (2009).
- Dielmans, I., Vingerling, J. R., Wolfs, R. C. W., Hofman, A., Grobbee, D. E., deJong, P. T. V. M. The prevalence of primary open-angle glaucoma in a population based study in The Netherlands: the Rotterdam Study. Ophthalmology. 101, 1851-1855 (1994).
- Lichter, P. R., et al. Interim clinical outcomes in the Collaborative Initial Glaucoma Treatment Study comparing initial treatment randomized to medications or surgery. Ophthalmology. 108 (11), 1943-1953 (2001).
- Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Arch. Ophthalmol. 120 (10), 1268-1279 (2002).
- Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Arch. Ophthalmol. 120 (6), 701-713 (2002).
- Beidoe, G., Mousa, S. A. Current primary open-angle glaucoma treatments and future directions. Clin. Ophthalmol. 6, 1699-1707 (2012).
- Jeong, J. H., Park, K. H., Jeoung, J. W., Kim, D. M. Preperimetric normal tension glaucoma study: long-term clinical course and effect of therapeutic lowering of intraocular pressure. Acta. Ophthalmol. 92 (3), e185-e193 (2014).
- Morrison, J. C., Moore, C. G., Deppmeier, L. M., Gold, B. G., Meshul, C. K., Johnson, E. C. A Rat Model of Chronic Pressure-Induced Optic Nerve Damage. Exp. Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).
- Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. Rat Models for Glaucoma Research. Prog. Brain Res. 173, 285-301 (2008).
- Iwamoto, K., Birkholz, P., Schipper, A., Mata, D., Linn, D. M., Linn, C. L. A Nicotinic Acetylcholine Receptor Agonist Prevents Loss of Retinal Ganglion Cells in a Glaucoma Model. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (2), 1078-1087 (2014).
- Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G. Limbal Microvasculature of the Rat Eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36 (3), 751-756 (1995).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse Models of Retinal Ganglion Cell Death and Glaucoma. Exp. Eye Res. 88 (4), 816-824 (2009).
- Maass, A., et al. Assessment of Rat and Mouse RGC Apoptosis Imaging in Vivo with Different Scanning Laser Ophthalmoscopes. Curr. Eye Res. 32 (10), 851-861 (2007).
- Li, Y., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Experimental induction of retinal ganglion cell death in adult mice. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 40 (5), 1004-1008 (1999).
- Gross, R. L., et al. A mouse model of elevated intraocular pressure: retina and optic nerve findings. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 101, 163-171 (2003).
- Cenni, M. C., Bonfanti, L., Martinou, J. C., Ratto, G. M., Strettoi, E., Maffei, L. Long-term survival of retinal ganglion cells following optic nerve section in adult bcl-2 transgenic mice. Eur. J. Neurosci. 8 (8), 1735-1745 (1996).
- Templeton, J. P., Geisert, E. E. A practical approach to optic nerve crush in the mouse. Mol. Vis. 18, 2147-2152 (2012).
- Schlamp, C. L., Johnson, E. C., Li, Y., Morrison, J. C., Nickells, R. W. Changes in Thy1 gene expression associated with damaged retinal ganglion cells. Mol. Vis. 7, 192-201 (2001).
- Libby, R. T., et al. Susceptibility to neurodegeneration in a glaucoma is modified by Bax gene dosage. PLoS Genet. 1, 17-26 (2005).
- Yang, Z., et al. Changes in gene expression in experimental glaucoma and optic nerve transection: the equilibrium between protective and detrimental mechanisms. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (12), 5539-5548 (2007).
- Huang, W., Fileta, J., Guo, Y., Grosskreutz, C. L. Downregulation of Thy1 in retinal ganglion cells in experimental glaucoma. Curr. Eye Res. 31 (3), 265-271 (2006).
- Smedowski, A., Pietrucha-Dutczak, M., Kaarniranta, K., Lewin-Kowalik, J. A rat experimental model of glaucoma incorporating rapid-onset elevation of intraocular pressure. Sci. Rep. 4, 1-11 (2014).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Exp. Eye Res. 91 (3), 415-424 (2010).
- Pease, M. E., Cone, F. E., Gelman, S., Son, J. L., Quigley, H. A. Calibration of the TonoLab tonometer in mice with spontaneous or experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (2), 858-864 (2011).
- Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 99, 27-35 (2012).
- Frankfort, B. J., et al. Elevated intraocular pressure causes inner retinal dysfunction before cell loss in a mouse model of experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (1), 762-770 (2013).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53 (7), 3847-3857 (2012).
- Cone-Kimball, E., et al. Scleral structural alterations associated with chronic experimental intraocular pressure elevation in mice. Mol. Vis. 19, 2023-2039 (2013).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).
- WoldeMussie, E., Ruiz, G., Wijono, M., Wheeler, L. A. Neuroprotection of retinal ganglion cells by brimonidine in rats with laser-induced chronic ocular hypertension. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42 (12), 2849-2855 (2001).
- Garcia-Valenzuela, E., Shareef, S., Walsh, J., Sharma, S. C. Programmed cell death of retinal ganglion cells during experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 61 (1), 33-44 (1995).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Experimental mouse ocular hypertension: establishment of the model. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (10), 4314-4320 (2003).
- Ji, J., et al. Effects of elevated intraocular pressure on mouse retinal ganglion cells. Vision Res. 45 (2), 169-179 (2005).
- Flammer, J., et al. The eye and the heart. Eur. Heart J. 34 (17), 1270-1278 (2013).
- Gugleta, K., et al. Association between risk factors and glaucomatous damage in untreated primary open-angle glaucoma. J. Glaucoma. 22 (6), 501-505 (2013).
- Mozaffarieh, M., Flammer, J. New insights in the pathogenesis and treatment of normal tension glaucoma. Curr. Opin. Pharmacol. 13 (1), 43-49 (2013).
