Blastulae विकास के सर्जिकल फ्यूजन द्वारा Parabiotic zebrafish भ्रूण की जनरेशन
Summary
This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.
Abstract
विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के दो पशुओं की शल्य parabiosis सेल आंतरिक बनाम अलग आनुवंशिक सेटिंग्स में ब्याज की उम्मीदवार जीन, कोशिकाओं के प्रवासी व्यवहार, और secreted संकेतों के लिए सेल-बाह्य भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा परिदृश्य बनाता है। parabiotic जानवरों एक आम प्रचलन का हिस्सा है क्योंकि, एक जानवर से किसी भी रक्त या रक्त जनित कारक अपने साथी के साथ और इसके विपरीत विमर्श किया जाएगा। इस प्रकार, सेल और आणविक कारकों एक आनुवंशिक पृष्ठभूमि से व्युत्पन्न एक दूसरे आनुवंशिक पृष्ठभूमि के संदर्भ में अध्ययन किया जा सकता है। वयस्क चूहों के Parabiosis अनुसंधान उम्र बढ़ने, कैंसर, मधुमेह, मोटापा, और मस्तिष्क के विकास के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है। हाल ही में, zebrafish भ्रूण की parabiosis hematopoiesis की विकासात्मक जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। चूहों के विपरीत, zebrafish भ्रूण की पारदर्शी प्रकृति parabiotic संदर्भ में कोशिकाओं के प्रत्यक्ष दृश्य परमिट, यह एफ की जांच के लिए एक विशिष्ट शक्तिशाली विधि बनानेundamental सेलुलर और आणविक तंत्र। इस तकनीक की उपयोगिता, तथापि, parabiotic zebrafish भ्रूण पैदा करने के लिए एक तेजी से सीखने की अवस्था के द्वारा सीमित है। इस प्रोटोकॉल कैसे शल्य चिकित्सा द्वारा विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के दो zebrafish भ्रूण की blastulae फ्यूज करने के लिए ब्याज की उम्मीदवार जीन की भूमिका की जांच करने पर एक कदम-दर-कदम तरीका प्रदान करता है। इसके अलावा, parabiotic zebrafish भ्रूण गर्मी झटका करने के लिए सहिष्णु हैं, जीन अभिव्यक्ति संभव के अस्थायी नियंत्रण बना रही है। इस पद्धति का एक परिष्कृत सेट-अप की आवश्यकता होती है और भ्रूण के विकास के दौरान विवो में सेल प्रवास, भाग्य विनिर्देश, और भेदभाव के अध्ययन के लिए व्यापक आवेदन किया है नहीं है।
Introduction
जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों के बीच आनुवंशिक मोज़ाइक (काइमेरा) का निर्माण सेल आंतरिक बनाम उम्मीदवार जीन 1-6 की सेल-बाह्य कार्यों की जांच के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित और शास्त्रीय रणनीति है। Zebrafish में ब्लासटुला प्रत्यारोपण व्यापक रूप से सेल स्वायत्तता 7-9 की पढ़ाई के लिए chimeric भ्रूण उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया है। ब्याज के ऊतकों पर निर्भर करता है, हालांकि, यह चुनौतीपूर्ण जाहिर वांछित ऊतक (जैसे, रक्त) 1-3, 7-9 करने के लिए दाता कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए हो सकता है। माउस जेनेटिकविदों लंबे parabiotic शल्य चिकित्सा पद्धतियों का उपयोग किया है एक साझा परिसंचरण 10-14 के साथ संयुक्त जीवों उत्पन्न करते हैं। Parabiotic जानवरों एक आम खून का हिस्सा है क्योंकि, कोशिकाओं है कि एक अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि के अन्य जानवर की कोशिकाओं के साथ एक जानवर से उत्पन्न बीच बातचीत 10-16 का अध्ययन किया जा सकता है। हाल ही में, करीमा किस्सा समूह सुंदर ढंग से रचनात्मक क्षमता का प्रदर्शनसंयुक्त zebrafish भ्रूण खाया और फिर hematopoietic स्टेम और पूर्वज सेल (HSPC) प्रवास 15 अध्ययन करने के लिए इस प्रणाली का उपयोग करें। इसके अलावा, zebrafish parabiosis हाल ही में hematopoietic स्टेम सेल (एचएससी) उद्भव और प्रवास, 16 में endothelial cadherin 5 की भूमिका की जांच करने के लिए और zebrafish विकास 17 के दौरान HSPC आला में stromal कोशिकाओं की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।
चूहों के विपरीत, zebrafish भ्रूण पारदर्शी हैं और parabiotic विकास के दौरान कोशिकाओं के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देते हैं, प्रणाली विशिष्ट शक्तिशाली बना रही है। zebrafish में parabiosis की उपयोगिता, तथापि, एक तेजी से सीखने की अवस्था है, और नाजुक भ्रूण पर parabiotic सर्जरी द्वारा सीमित विस्तृत निर्देश और दृश्य प्रदर्शन के बिना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य स्पष्ट है, कदम दर कदम निर्देश कैसे अध्ययन करने के लिए parabiotic zebrafish भ्रूण उत्पन्न करने पर वीडियो आधारित ट्यूटोरियल के साथ करने का एक सेट प्रदान करने के लिए हैलौकिक, सेल आंतरिक, या एक उम्मीदवार जीन (एस) blastulae के विकास के लिए शल्य चिकित्सा द्वारा संलयन की सेल-बाह्य कार्य करता है। कुंजी संशोधनों और बढ़ती parabiont अस्तित्व और नए प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए अतिरिक्त सिफारिशें शामिल हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
Parabiotic संलयन वयस्क murine मॉडल और लड़की भ्रूण 10-14 में उम्मीदवार जीन की सेलुलर कार्यों की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण किया गया है। अभी हाल ही में एक ब्लासटुला फ्यूजन विधि संयुक्त zebrafish भ्रूण 15 पैदा करन?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Julie R. Perlin for helpful comments on the manuscript. D.I.S. is supported by grants from the American Society of Hematology, the Cooley’s Anemia Foundation, and the NIH (K01DK085217 and R03DK100672). E.J.H. is a Howard Hughes Medical Institute Fellow of the Helen Hay Whitney Foundation. B.L. is a Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. is supported by an Irvington Fellowship from the Cancer Research Institute and a Young Investigator Award from the Conquer Cancer Foundation of ASCO. L.I.Z. is supported by grants from the NIH (R01CA103846, P01HL032262, and R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute, and is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | |
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 |
| Name | Company | Catalog Number |
| Antibiotics: | ||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A |
| 10 mL pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 |
| PTU. working stock is 0.003% (50X is 0.15%). for 500ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | ||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
Riferimenti
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