Generazione di Parabiotic embrioni di zebrafish da fusione chirurgica di Sviluppo Blastulae
Summary
This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.
Abstract
parabiosis chirurgica di due animali di differenti background genetico crea uno scenario unico per lo studio delle cellule-intrinseco rispetto a ruoli di cellule-estrinseca per geni candidati di interesse, i comportamenti migratori delle cellule, e segnali secreti in contesti genetici distinti. Perché gli animali parabiotic condividono una circolazione comune, il sangue o fattore ematica da un animale saranno scambiati con il suo partner e viceversa. Così, cellule e fattori molecolari derivate da uno sfondo genetico possono essere studiati nel contesto di una seconda background genetico. Parabiosis di topi adulti è stato ampiamente utilizzato per l'invecchiamento della ricerca, il cancro, il diabete, l'obesità, e lo sviluppo del cervello. Più di recente, parabiosis di embrioni di zebrafish è stato utilizzato per studiare la biologia dello sviluppo di emopoiesi. In contrasto con i topi, la natura trasparente di embrioni di zebrafish permette la visualizzazione diretta delle cellule nel contesto parabiotic, che lo rende un metodo unico potente per indagare fmeccanismi cellulari e molecolari FONDAMENTALI. L'utilità di questa tecnica, tuttavia, è limitata da una curva di apprendimento ripida per generare gli embrioni zebrafish parabiotic. Questo protocollo fornisce un metodo passo-passo su come fondere chirurgicamente la blastulae di due embrioni di zebrafish di diversi background genetici per studiare il ruolo dei geni candidati di interesse. Inoltre, gli embrioni di zebrafish parabiotic sono tolleranti a shock termico, rendendo il controllo temporale dell'espressione genica possibile. Questo metodo non richiede un sofisticato set-up e ha ampie applicazioni per lo studio migrazione delle cellule, specifica il destino, e la differenziazione in vivo durante lo sviluppo embrionale.
Introduction
La creazione di mosaici genetici (chimere) tra wild-type e animali geneticamente modificati è una strategia ben consolidata e classica per indagare cellule intrinseca contro le funzioni delle cellule-estrinseca di geni candidati 1-6. Blastula trapianto in zebrafish è stato ampiamente utilizzato per generare embrioni chimerici per gli studi di cellule-autonomia 7-9. A seconda del tessuto di interesse, tuttavia, può essere difficile per indirizzare prevedibile cellule del donatore al tessuto desiderato (ad esempio, sangue) 1-3, 7-9. Genetisti mouse hanno a lungo utilizzato metodi chirurgici parabiotic per generare organismi congiunti con una tiratura condiviso 10-14. Perché gli animali parabiotic condividono un flusso sanguigno comune, le interazioni tra le cellule che ha avuto origine da un animale con cellule del altro animale di un diverso background genetico possono essere studiati 10-16. Di recente, il gruppo di Karima Kissa elegantemente dimostrato la capacità di create embrioni di zebrafish siamesi e quindi utilizzare questo sistema per studiare staminali ematopoietiche e la migrazione 15 cellule progenitrici (HSPC). Inoltre, parabiosis zebrafish è stato recentemente utilizzato per studiare il ruolo della caderina endoteliali 5 di cellule staminali ematopoietiche (HSC) comparsa e la migrazione, e 16 per studiare il ruolo delle cellule stromali nella nicchia HSPC durante lo sviluppo zebrafish 17.
A differenza di topi, embrioni di zebrafish sono trasparenti e consentono la visualizzazione diretta delle cellule durante lo sviluppo parabiotic, rendendo il sistema unico potente. L'utilità di parabiosis in zebrafish, tuttavia, è limitato da una ripida curva di apprendimento, e la chirurgia parabiotic sugli embrioni delicati può essere tecnicamente impegnativo, senza istruzioni dettagliate e dimostrazione visiva. L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire una serie di chiare istruzioni passo-passo per accompagnare video tutorial basati su come generare embrioni di zebrafish parabiotic per lo studiotemporale, cellule intrinseca, o funzioni delle cellule-estrinseca di un gene candidato (s) dalla fusione chirurgica di sviluppare blastulae. modifiche chiave e ulteriori raccomandazioni per aumentare la sopravvivenza parabiont e nuove applicazioni sperimentali sono inclusi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fusion Parabiotic è stato un potente strumento per studiare le funzioni cellulari di geni candidati in modelli murini adulti e embrioni di pollo 10-14. Più di recente, un metodo di fusione blastula è stata descritta per la generazione di embrioni di zebrafish siamesi 15. Nel presente protocollo, video tutorial-based sono utilizzati per dimostrare e meglio descrivere la metodologia per la creazione di parabiotic embrioni di zebrafish di diversi background genetico al fine di studiare i ruoli temp…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Julie R. Perlin for helpful comments on the manuscript. D.I.S. is supported by grants from the American Society of Hematology, the Cooley’s Anemia Foundation, and the NIH (K01DK085217 and R03DK100672). E.J.H. is a Howard Hughes Medical Institute Fellow of the Helen Hay Whitney Foundation. B.L. is a Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. is supported by an Irvington Fellowship from the Cancer Research Institute and a Young Investigator Award from the Conquer Cancer Foundation of ASCO. L.I.Z. is supported by grants from the NIH (R01CA103846, P01HL032262, and R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute, and is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | |
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 |
| Name | Company | Catalog Number |
| Antibiotics: | ||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A |
| 10 mL pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 |
| PTU. working stock is 0.003% (50X is 0.15%). for 500ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | ||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
Riferimenti
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