Génération de parabiose Zebrafish Embryons par Fusion chirurgicale de développement blastulas
Summary
This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.
Abstract
parabiose chirurgicale de deux animaux de différentes origines génétiques crée un scénario unique pour étudier la cellule intrinsèque par rapport à des rôles de cellules extrinsèque pour les gènes candidats d'intérêt, les comportements migratoires des cellules, et des signaux sécrétées dans les milieux génétiques distincts. Parce que les animaux parabiose partagent une circulation commune, de sang ou d'un facteur par le sang d'un animal ne sera échangée avec son partenaire et vice-versa. Ainsi, les cellules et les facteurs moléculaires dérivées d'un fond génétique peuvent être étudiés dans le cadre d'un deuxième arrière-plan génétique. Parabiose des souris adultes a été largement utilisé pour le vieillissement de la recherche, le cancer, le diabète, l'obésité et le développement du cerveau. Plus récemment, parabiose des embryons de poisson zèbre a été utilisé pour étudier la biologie du développement de l'hématopoïèse. Contrairement aux souris, la nature transparente des embryons de poisson zèbre permet la visualisation directe des cellules dans le contexte parabiose, ce qui en fait une méthode unique et puissant pour étudier fmécanismes cellulaires et moléculaires FONDAMENTAUX. L'utilité de cette technique, cependant, est limitée par une courbe d'apprentissage abrupte pour générer les embryons de poisson zèbre parabiose. Ce protocole fournit une méthode étape par étape sur la façon de fusionner chirurgicalement l'blastulas de deux embryons de poisson zèbre de différentes origines génétiques pour étudier le rôle des gènes candidats d'intérêt. En outre, les embryons de poisson zèbre parabiose sont tolérants au choc thermique, ce qui rend le contrôle temporel de l'expression du gène possible. Cette méthode ne nécessite pas un système sophistiqué set-up et a de larges applications pour l' étude de la migration des cellules, la spécification du destin, et la différenciation in vivo au cours du développement embryonnaire.
Introduction
Création de mosaïques génétiques (chimères) entre type sauvage et les animaux génétiquement modifiés est une stratégie bien établie et classique pour étudier la cellule intrinsèque par rapport à des fonctions cellulaires extrinsèque de gènes candidats 1-6. Blastula transplantation chez le poisson zèbre a été largement utilisé pour générer des embryons chimères pour les études de cellules-autonomie 7-9. Selon le tissu d'intérêt, cependant, il peut être difficile de cibler de manière prévisible les cellules du donneur au tissu désiré (par exemple, le sang) 1-3, 7-9. Généticiens souris ont longtemps utilisé des méthodes chirurgicales parabiose pour générer des organismes conjoints avec une circulation partagée 10-14. Étant donné que les animaux parabiose partagent un flux sanguin commun, les interactions entre les cellules qui proviennent d'un animal avec des cellules d'un autre animal d'un arrière – plan génétique différent peuvent être étudiés 10-16. Récemment, le groupe de Karima Kissa a démontré avec élégance la capacité de cremangé embryons de poisson zèbre conjoints et ensuite utiliser ce système pour étudier souches hématopoïétiques et cellules progénitrices (HSPC) migration 15. En outre, parabiose zebrafish a récemment été utilisé pour étudier le rôle de la cadhérine endothéliale 5 dans la cellule souche hématopoïétique (CSH) émergence et la migration, 16 et d'étudier le rôle des cellules stromales dans le créneau HSPC au cours du développement zebrafish 17.
Contrairement à des souris, des embryons de poisson zèbre sont transparents et permettent une visualisation directe des cellules au cours du développement parabiose, ce qui rend le système unique et puissant. L'utilité de parabiose zebrafish, cependant, est limitée par une courbe d'apprentissage abrupte, et la chirurgie parabiose sur les embryons délicats peuvent être techniquement difficile sans instructions détaillées et démonstration visuelle. L'objectif de ce protocole est de fournir un ensemble d'instructions étape par étape claires pour accompagner des didacticiels vidéo sur la façon de générer des embryons de poisson zèbre pour étudier parabiosetemporelle de cellule intrinsèque, ou des fonctions cellulaires extrinsèque d'un gène (s) candidat par fusion chirurgicale de développer blastulas. Les modifications clés et des recommandations supplémentaires pour augmenter la survie des parabiont et de nouvelles applications expérimentales sont incluses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fusion parabiose a été un outil puissant pour étudier les fonctions cellulaires de gènes candidats dans des modèles murins adultes et d' embryons de poulet 10-14. Plus récemment, une méthode blastula de fusion a été décrite pour la génération d' embryons de poisson zèbre conjoints 15. Dans le présent protocole, des didacticiels vidéo sont utilisés pour démontrer et mieux décrire la méthodologie pour la création d'embryons de poisson zèbre parabiose de différentes o…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Julie R. Perlin for helpful comments on the manuscript. D.I.S. is supported by grants from the American Society of Hematology, the Cooley’s Anemia Foundation, and the NIH (K01DK085217 and R03DK100672). E.J.H. is a Howard Hughes Medical Institute Fellow of the Helen Hay Whitney Foundation. B.L. is a Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. is supported by an Irvington Fellowship from the Cancer Research Institute and a Young Investigator Award from the Conquer Cancer Foundation of ASCO. L.I.Z. is supported by grants from the NIH (R01CA103846, P01HL032262, and R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute, and is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | |
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 |
| Name | Company | Catalog Number |
| Antibiotics: | ||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A |
| 10 mL pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 |
| PTU. working stock is 0.003% (50X is 0.15%). for 500ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | ||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
Riferimenti
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