Поколение парабиотического эмбрионов данио рерио хирургическим путем Fusion разработки Blastulae
Summary
This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.
Abstract
Хирургическая парабиозом двух животных разных генетических фонов создает уникальный сценарий для изучения клеток по сравнению с внутренней клеточной внешняя роли для генов-кандидатов, представляющих интерес, миграционным поведением клеток и спрятали сигналов в различных генетических условиях. Поскольку парабиотического животные имеют общую циркуляцию, любая кровь или фактор через кровь от одного животного будет обмениваться со своим партнером, и наоборот. Таким образом, клетки и молекулярные факторы, полученные из одного генетического фона могут быть изучены в контексте второго генетического фона. Парабиозе взрослых мышей широко используется для исследований старения, рака, диабета, ожирения и развития мозга. Совсем недавно, парабиозом из эмбрионов данио были использованы для изучения биологии развития кроветворения. В отличие от мышей, прозрачный характер эмбрионов данио позволяет прямой визуализации клеток в парабиотического контексте, что делает его уникальным мощным методом исследования пundamental клеточные и молекулярные механизмы. Полезность этого метода, однако, ограничена крутой кривой обучения для генерации парабиотического эмбрионов данио рерио. Этот протокол обеспечивает метод шаг за шагом о том, как хирургическим путем сплавления blastulae двух эмбрионов данио различных генетических фонов для изучения роли генов-кандидатов, представляющих интерес. Кроме того, парабиотического данио эмбрионы толерантны к тепловому удару, что делает временной контроль экспрессии гена возможно. Этот метод не требует сложного настройки и имеет широкое применение для изучения миграции клеток, спецификации судьбы и дифференциации в естественных условиях во время эмбрионального развития.
Introduction
Создание генетических мозаик (химер) между дикого типа и генетически модифицированных животных является устоявшейся и классическая стратегия для исследования клеток внутренней клеточной сравнению внешняя функций генов – кандидатов 1-6. Бластулы трансплантации в данио широко используется для получения химерных эмбрионов для исследований клеточной автономии 7-9. В зависимости от интересующей ткани, тем не менее, она может быть сложной задачей , чтобы предсказуемо целевых донорских клеток в требуемую ткань (например, крови) 1-3, 7-9. Генетики мыши уже давно используются парабиотического хирургические методы для создания сиамских организмов с общим тиражом 10-14. Поскольку парабиотического животные имеют общую кровеносную систему , взаимодействие между клетками , которые произошли от одного животного с клетками другого животного другого генетического фона могут быть изучены 10-16. В последнее время группа Карима Kissa в элегантно продемонстрировал способность CREели сиамских эмбрионов данио рерио , а затем использовать эту систему для изучения гемопоэтических стволовых и клеток – предшественников (HSPC) миграции 15. Кроме того, данио парабиозом недавно был использован для изучения роли эндотелиальной кадгерину 5 в гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) возникновения и миграции, 16 и изучить роль стромальных клеток в нише HSPC во время данио развития 17.
В отличие от мышей, данио эмбрионы являются прозрачными и позволяют для прямой визуализации клеток в процессе развития парабиотического, что делает систему однозначно мощным. Полезность парабиозе в данио, однако, ограничена крутой кривой обучения, и парабиотического операции на тонких эмбрионов может быть технически сложным без подробной инструкции и визуальной демонстрации. Целью данного протокола является предоставление набора четких, шаг за шагом инструкции для сопровождения видео на основе руководства о том, как генерировать парабиотического данио эмбрионов для изучениявременная, клетка-внутренняя, или клеточные функции внешняя гена кандидата (ов) хирургическим путем слияния разработки blastulae. Основные модификации и дополнительные рекомендации по увеличению выживаемости parabiont и новых экспериментальных приложений включены.
Protocol
Representative Results
Discussion
Парабиотического слияние было мощным инструментом для исследования клеточных функций генов – кандидатов у взрослых мышиных моделях и куриных эмбрионов 10-14. Совсем недавно, метод бластула фьюжн был описан для генерации сиамских эмбрионов данио 15. В настоящем протоколе, вид?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Julie R. Perlin for helpful comments on the manuscript. D.I.S. is supported by grants from the American Society of Hematology, the Cooley’s Anemia Foundation, and the NIH (K01DK085217 and R03DK100672). E.J.H. is a Howard Hughes Medical Institute Fellow of the Helen Hay Whitney Foundation. B.L. is a Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. is supported by an Irvington Fellowship from the Cancer Research Institute and a Young Investigator Award from the Conquer Cancer Foundation of ASCO. L.I.Z. is supported by grants from the NIH (R01CA103846, P01HL032262, and R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute, and is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | |
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 |
| Name | Company | Catalog Number |
| Antibiotics: | ||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A |
| 10 mL pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 |
| PTU. working stock is 0.003% (50X is 0.15%). for 500ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | ||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
Riferimenti
- Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
- Li, P., et al. Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment. Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).
- Tam, P. P., Rossant, J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).
- Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development. Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).
- Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis. Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).
- Parker, L., Stainier, D. Y. Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis. Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).
- Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish. Development. 3 (3), 649-659 (2002).
- Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).
- Hervey, G. R. The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats. J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).
- Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche. Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).
- Dieterlen-Lièvre, F., Martin, C., Beaupain, D. Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system. Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).
- Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies). Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).
- Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation. Nat Commun. 28 (6), 8375 (2015).
- Shah, D. I., et al. Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts. Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).
- Adám, A., Bártfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orbán, L. Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish. Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).
