Die Erzeugung von Parabiotic Zebrabärbling Embryonen, die durch chirurgische Fusion der Entwicklung Blastulae
Summary
This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.
Abstract
Chirurgische Parabiose von zwei Tiere von verschiedenen genetischen Hintergründe schafft ein einzigartiges Szenario Zell-Eigengegenüber zell extrinsische Rollen für Kandidatengene von Interesse, Migrationsverhalten von Zellen zu untersuchen, und sekretiertes Signale in unterschiedlichen genetischen Einstellungen. Da parabiotic Tiere eine gemeinsame Kreislauf, jede Blut oder durch Blut übertragbaren Faktor von einem Tier gemeinsam mit dem Partner ausgetauscht werden und umgekehrt. So ist aus einem genetischen Hintergrund abgeleiteten Zellen und molekularen Faktoren kann im Kontext eines zweiten genetischen Hintergrund studiert werden. Parabiose von erwachsenen Mäusen wurde intensiv für die Forschung Alterung, Krebs, Diabetes, Fettleibigkeit, und die Entwicklung des Gehirns eingesetzt. In jüngerer Zeit hat Parabiose von Genaktivität verwendet worden, um die Entwicklungsbiologie der Hämatopoese zu studieren. Im Gegensatz zu Mäusen erlaubt die transparente Natur der Genaktivität die direkte Visualisierung von Zellen im parabiotic Zusammenhang ist ein einmalig leistungsfähiges Verfahren zur Untersuchung von f machenundamental zellulären und molekularen Mechanismen. Die Nützlichkeit dieser Technik wird jedoch durch eine steile Lernkurve begrenzt für die parabiotic Genaktivität zu erzeugen. Dieses Protokoll stellt eine Schritt-für-Schritt-Methode, wie die Blastulae von zwei Genaktivität von verschiedenen genetischen Hintergründen chirurgisch verschmelzen die Rolle der Kandidaten-Gene von Interesse zu untersuchen. Darüber hinaus sind die parabiotic Zebrabärblingembryonen Hitzeschock-tolerant, mögliche zeitliche Kontrolle der Genexpression zu machen. Diese Methode ist nicht ein ausgeklügeltes Set-up erfordert und hat breite Anwendungen für das Studium der Zellmigration, das Schicksal der Beschreibung und Differenzierung in vivo während der embryonalen Entwicklung.
Introduction
Erstellung von genetischen Mosaiken (Chimären) zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderten Tieren ist eine gut etablierte und klassische Strategie zur Untersuchung von Zell-Eigengegenüber zell extrinsische Funktionen von Kandidatengenen 1-6. Blastula Transplantation in Zebrabärbling wurde in großem Umfang Chimären – Embryonen für die Untersuchung der Zell Autonomie 7-9 zu erzeugen , verwendet werden . In Abhängigkeit von dem Gewebe von Interesse kann es jedoch schwierig sein , vorhersagbar 7-9 Donorzellen zu dem gewünschten Gewebe (zB Blut) 1-3, abzuzielen. Maus – Genetiker haben lange parabiotic chirurgische Methoden verwendet , um verbundene Organismen mit einem gemeinsamen Kreislauf 10-14 erzeugen. Da die Tiere parabiotic eine gemeinsame Blutstrom, Wechselwirkungen zwischen Zellen teilen , die von einem Tier mit Zellen des anderen Tieres von einem anderen genetischen Hintergrund hat , kann 10-16 untersucht werden. Vor kurzem elegant Karima Kissa Gruppe demonstriert die Fähigkeit, creaß verbunden Genaktivität und dann dieses System verwenden , um 15 hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzelle (HSPC) Migration studieren. Darüber hinaus wurde kürzlich Zebrabärbling Parabiose während Zebrabärblingentwicklung 17 zur Untersuchung der Rolle der endothelialen cadherin 5 in hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Emergenz und Migration, 16 und zur Untersuchung der Rolle von Stromazellen in der HSPC Nische eingesetzt.
Im Gegensatz zu Mäusen sind Genaktivität transparent und ermöglichen eine direkte Visualisierung von Zellen während der parabiotic Entwicklung, so dass das System einzigartig leistungsfähige. Die Nützlichkeit von Parabiose in Zebrabärbling, wird jedoch durch eine steile Lernkurve begrenzt und parabiotic Operation an den empfindlichen Embryonen ohne detaillierte Anleitung und visuelle Demonstration technisch anspruchsvoll sein. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Reihe von klaren, Schritt-für-Schritt-Anleitungen Videoschulungen auf zu begleiten, wie parabiotic Zebrabärblingembryonen erzeugen für das Studiumtemporal, zell intrinsische oder extrinsische zell Funktionen eines Kandidatengens (e) durch chirurgische Fusion von Blastulae entwickeln. Key Modifikationen und zusätzliche Empfehlungen zur Erhöhung parabiont Überleben und neue experimentelle Anwendungen sind im Lieferumfang enthalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Parabiotic Fusion ist ein leistungsfähiges Werkzeug gewesen , um zelluläre Funktionen von Kandidatengenen bei erwachsenen Mausmodellen und Hühnerembryonen 14.10 untersuchen. In jüngerer Zeit wurde zur Erzeugung verbunden Zebrabärbling – Embryonen 15 a blastula Fusionsverfahren beschrieben. Im vorliegenden Protokoll, Video-basierte Tutorials werden verwendet, um die Methodik zu demonstrieren und besser zu beschreiben für die Erstellung von parabiotic Genaktivität von verschiedenen genetischen…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Julie R. Perlin for helpful comments on the manuscript. D.I.S. is supported by grants from the American Society of Hematology, the Cooley’s Anemia Foundation, and the NIH (K01DK085217 and R03DK100672). E.J.H. is a Howard Hughes Medical Institute Fellow of the Helen Hay Whitney Foundation. B.L. is a Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. is supported by an Irvington Fellowship from the Cancer Research Institute and a Young Investigator Award from the Conquer Cancer Foundation of ASCO. L.I.Z. is supported by grants from the NIH (R01CA103846, P01HL032262, and R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute, and is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | |
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 |
| Name | Company | Catalog Number |
| Antibiotics: | ||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A |
| 10 mL pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 |
| PTU. working stock is 0.003% (50X is 0.15%). for 500ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | ||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
Riferimenti
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